一种磁固定床快速固定化细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种磁固定床快速固定化细胞的方法，具有过程简单、耗能小、耗时短、设备简单、可连续操作、对固定化的细胞活性影响较小、方便装载和卸载细胞等一系列优点，在生物催化等领域有着广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种磁固定床快速固定化细胞的方法
本专利技术属于细胞固定化
，特别是将发酵液中的细胞快速固定化的方法，具体涉及一种磁固定床快速固定化细胞的方法。
技术介绍
细胞固定化是全细胞催化和发酵过程中重复利用细胞的重要方法，对提高工业过程的生产效率、节约成本具有重要的意义。常见的活细胞固定化方法主要有吸附和包埋法，吸附法固定的细胞密度较小，因而包埋法成为最常用的活细胞固定化方法。包埋法的基本过程为：首先，通过离心、沉淀或过滤的方法先从发酵液中收集细胞，然后对细胞进行洗涤以除去表面的有害代谢物，再次进行离心、沉淀或过滤的方法收集细胞；其次，将细胞和高分子材料(譬如海藻酸钠、卡拉胶、PVA等)剧烈搅拌混合均匀；再次，将上述混合液滴入凝聚液中形成包埋有细胞的胶囊，尺寸为几百微米到几毫米之间；最后，将制得的胶囊洗涤除去表面的凝聚液，方可用于培养和生物转化。这种传统的包埋法固定化细胞的方法具有一系列缺点：1、收集细胞洗涤细胞过程繁琐；2、与高分子材料剧烈混合时，细胞极易失活；3、形成的微胶囊尺寸较大，往往存在内扩散限制；4、整个制备过程操作繁琐，时间较长，成本较高。因此，专利技术一种快速固定化细胞用于生物催化的方法意义重大。目前已有一些利用磁固定床对细胞进行固定化的方法，但传统的磁固定床多以铁磁性物质作为导磁性介质，如铁粉、铁丝、钢丝、钢球等，这些导磁介质在移去磁场后仍会有剩磁，进而会导致通过磁场附着在床层中的超顺磁颗粒难以洗脱，严重阻碍磁固定床在固定化细胞方面的重复利用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种磁固定床快速固定化细胞的方法，该方法对固定化的细胞活性影响较小，操作过程简单，具有通用性，可广泛用于全细胞催化过程中的细胞固定化。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种磁固定床快速固定化细胞的方法，包括：1)制备超顺磁流体：将二价铁离子与三价铁离子按摩尔比1:1.5～2.5的比例混合，加热到70～90℃，每升反应液快速加入110～130mL浓氨水，继续快速搅拌0.5～2h，反应完成后磁分离，去除上清液，得超顺磁流体；2)制备超顺磁导磁介质：取内径0.1～0.3mm、壁厚0.05～0.2mm、长度200～500mm的空心毛细玻璃管，在管内将步骤1)制备好的超顺磁流体填入，在永磁体辅助下移去超顺磁流体中的分散液，在空心毛细玻璃管中完全填满超顺磁颗粒，真空干燥后，封闭空心毛细玻璃管两端端口，形成封闭在玻璃毛细管中的超顺磁导磁介质；3)制备磁固定床反应器：在直径10～50mm，长度200～500mm的有机玻璃管中填充数根步骤2)制备的封闭在玻璃毛细管中的超顺磁导磁介质，直至有机玻璃管内被玻璃毛细管填满，玻璃毛细管之间形成的空隙可方便尺寸小于空隙的颗粒、液体自由通过；在有机玻璃管外缠绕1～10层铜丝，每层500～1000匝铜丝，铜丝直径100～500μm，组成螺线管，得到磁固定床反应器；通电后螺线管内部产生磁场，并通过封闭在玻璃毛细管中的超顺磁导磁介质将磁场表面强化；4)制备与细胞相互作用的磁流体：将二价铁离子与三价铁离子按摩尔比1:1.5～2.5的比例混合，加热到70～90℃，每升反应液快速加入110～130mL浓氨水，反应8～12min后，每升反应体系逐滴加入10～50mL浓度为4～6M的多元酸或其盐；继续在65～75℃的温度下快速搅拌0.2～2h，反应完成后磁分离，去除上清液，每升反应液剩余部分重新分散于90～110mL去离子水中，得到与细胞相互作用的表面带负电的磁流体；5)取培养好的细胞悬浮液0.2～2L(细胞浓度为108～1010)，加入步骤4)制备的与细胞相互作用的磁流体5～20mL，调节pH为3～5或另外加入氯化钠调节盐浓度0.2～0.8mol/L，搅拌混合后得到细胞磁流体混合液；调节磁固定床反应器螺线管电流0.5～2A，将细胞磁流体混合液以5～20mL/min的流速通入磁固定床反应器，细胞在磁流体的协助下吸附于磁固定床反应器内的封闭在玻璃毛细管中的超顺磁导磁介质表面，得到固定在磁固定床反应器的床层中的固定化细胞。进一步地，可以通入缓冲液洗涤磁固定床反应器中的细胞，洗涤完成后便得到直接固定在床层中的固定化细胞，可用于后续的生物转化。进一步地，如需将磁固定床反应器中的固定化细胞洗脱下来，可在磁固定床反应器中通入洗脱液并断电，磁固定床反应器内超顺磁导磁介质的磁场完全消失，细胞与超顺磁导磁介质脱附，随洗脱液流出磁场。进一步地，所述步骤1)中的二价铁离子的浓度为0.15～0.25mol/L，三价铁离子的浓度为0.35～0.45mol/L。进一步地，所述步骤4)中的二价铁离子的浓度为0.15～0.25mol/L，三价铁离子的浓度为0.35～0.45mol/L。进一步地，所述步骤4)中的多元酸或其盐为壬二酸、柠檬酸、柠檬酸钠、乙二酸等中的至少一种。进一步地，所述步骤5)中，将细胞磁流体混合通入磁固定床反应器时，采用泵输送细胞磁流体混合液，下方进料，上方出料；可以通过调节通过螺线管的电流，调节磁场大小；如有必要，可在上述磁固定床反应器外通过夹套控制磁固定床反应器内的反应温度；进一步地，所述步骤5)中的细胞悬浮液，主要为单细胞悬浮液，如大肠杆菌、酵母、乳酸菌、芽孢杆菌等的悬浮液。进一步地，所述步骤5)中的调节盐浓度中采用的盐包括诸如氯化钠、磷酸盐、柠檬酸盐等对细胞无伤害的盐的总浓度。进一步地，所述步骤5)中的缓冲液为生理盐水或pH7.3～7.5的磷酸缓冲液。本技术方案与
技术介绍
相比，它具有如下优点：1、本专利技术实现细胞的快速简便磁修饰，可在几分钟内将细胞从悬液中快速固定化于磁固定床反应器，克服了传统细胞固定化方法过程繁琐、耗费时间长、细胞活性损失大的缺陷。2、本专利技术的细胞固定化方法，细胞是在磁流体辅助下直接吸附在导磁介质上，可以通过调控电流来控制磁场强度，实现细胞的吸附和解吸，便于更换固定化细胞。3、本专利技术提供的磁固定床反应器固定化细胞的方法，操作简便、设备简单、对细胞活性影响较小，可实现细胞的快速固定化和重复利用。4、本专利技术改进了与细胞相互作用的磁流体制备方法，与现有的磁流体制备方法相比大大简化，可以快速制备得到。同时，本专利技术还改进了磁固定床反应器的填充材料，采用超顺磁的填充材料，不会有剩磁现象产生。总之，本专利技术方法过程简单、耗能小、耗时短、设备简单、可连续操作、对分离的细胞活性影响较小，在生物催化等领域有着广泛的应用前景。附图说明下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步说明。图1为本专利技术的磁固定床反应器的示意图。图2为实施例7中游离细胞与固定化后洗脱细胞的生长曲线比较示意图。具体实施方式下面通过实施例具体说明本专利技术的内容：实施例11)制备超顺磁流体：将500mL浓度为0.4mol/L的三氯化铁溶液与500mL浓度为0.2mol/L的二氯化铁溶液等体积混合，剧烈搅拌，加热到70℃，每升反应液快速加入120mL浓氨水(25～28％)，继续快速搅拌1h，反应完成后磁分离，去除上清液，得超顺磁流体；2)制备超顺磁导磁介质：取长度200mm、内径0.1mm、壁厚0.1mm的空心毛细玻璃管，在管内将步骤1)制备好的超顺磁流体填入，在永磁体辅助下移去超顺磁流体中的分散液，在空心毛细玻璃管中完全填满超顺本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种磁固定床快速固定化细胞的方法，其特征在于：包括：1)制备超顺磁流体：将二价铁离子与三价铁离子按摩尔比1:1.5～2.5的比例混合，加热到70～90℃，每升反应液加入110～130mL浓氨水，继续搅拌0.5～2h，反应完成后磁分离，去除上清液，得超顺磁流体；2)制备超顺磁导磁介质：取内径0.1～0.3mm、壁厚0.05～0.2mm、长度200～500mm的空心毛细玻璃管，在管内将步骤1)制备好的超顺磁流体填入，移去超顺磁流体中的分散液，在空心毛细玻璃管中完全填满超顺磁颗粒，干燥后封闭空心毛细玻璃管两端端口，形成封闭在玻璃毛细管中的超顺磁导磁介质；3)制备磁固定床反应器：在直径10～50mm，长度200～500mm的有机玻璃管中填充数根步骤2)制备的封闭在玻璃毛细管中的超顺磁导磁介质，直至有机玻璃管内被玻璃毛细管填满；在有机玻璃管外缠绕1～10层铜丝，每层500～1000匝铜丝，铜丝直径100～500μm，组成螺线管，得到磁固定床反应器；4)制备与细胞相互作用的磁流体：将二价铁离子与三价铁离子按摩尔比1:1.5～2.5的比例混合，加热到70～90℃，每升反应液加入110～130mL浓氨水，反应8～12min后，每升反应体系逐滴加入10～50mL浓度为4～6M的多元酸或其盐；继续在65～75℃的温度下搅拌0.2～2h，反应完成后磁分离，去除上清液，每升反应液剩余部分重新分散于90～110mL水中，得到与细胞相互作用的表面带负电的磁流体；5)取细胞浓度为108～1010的细胞悬浮液0.2～2L，加入步骤4)制备的与细胞相互作用的磁流体5～20mL，调节pH为3～5或调节盐浓度为0.2～0.8mol/L，搅拌混合后得到细胞磁流体混合液；调节磁固定床反应器螺线管电流0.5～2A，将细胞磁流体混合液以5～20mL/min的流速通入磁固定床反应器，细胞在磁流体的协助下吸附于磁固定床反应器内的封闭在玻璃毛细管中的超顺磁导磁介质表面，得到固定在磁固定床反应器的床层中的固定化细胞。...

【技术特征摘要】
1.一种磁固定床快速固定化细胞的方法，其特征在于：包括：1)制备超顺磁流体：将二价铁离子与三价铁离子按摩尔比1:1.5～2.5的比例混合，加热到70～90℃，每升反应液加入110～130mL浓氨水，继续搅拌0.5～2h，反应完成后磁分离，去除上清液，得超顺磁流体；2)制备超顺磁导磁介质：取内径0.1～0.3mm、壁厚0.05～0.2mm、长度200～500mm的空心毛细玻璃管，在管内将步骤1)制备好的超顺磁流体填入，移去超顺磁流体中的分散液，在空心毛细玻璃管中完全填满超顺磁颗粒，干燥后封闭空心毛细玻璃管两端端口，形成封闭在玻璃毛细管中的超顺磁导磁介质；3)制备磁固定床反应器：在直径10～50mm，长度200～500mm的有机玻璃管中填充数根步骤2)制备的封闭在玻璃毛细管中的超顺磁导磁介质，直至有机玻璃管内被玻璃毛细管填满；在有机玻璃管外缠绕1～10层铜丝，每层500～1000匝铜丝，铜丝直径100～500μm，组成螺线管，得到磁固定床反应器；4)制备与细胞相互作用的磁流体：将二价铁离子与三价铁离子按摩尔比1:1.5～2.5的比例混合，加热到70～90℃，每升反应液加入110～130mL浓氨水，反应8～12min后，每升反应体系逐滴加入10～50mL浓度为4～6M的多元酸或其盐；继续在65～75℃的温度下搅拌0.2～2h，反应完成后磁分离，去除上清液，每升反应液剩余部分重新分散于90～110mL水中，得到与细胞相互作用的表面带负电的磁流体；5)取细胞浓度为108～1010的细胞悬浮液0.2～2L，加入步骤4)制备的与细胞相互作用的磁流体5～20mL，调节pH为3～5或调节盐浓度为0.2～0.8mol/L，搅拌混合后得到细胞磁流体混合液；调节磁固定床反应器螺线管电流0.5～2A，将细胞磁流体混合液以5～20mL/min的流速通入磁固定床反应器，细胞在磁流体的协助...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈国，柠檬，赵珺，郭洪伟，陈宏文，
申请(专利权)人：华侨大学，厦门普睿迈格生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：福建,35