用于通过使用微生物纯化3，6-脱水-L-半乳糖的新颖方法技术

本发明专利技术涉及一种用于通过使用微生物来纯化3，6‑脱水‑L‑半乳糖的新颖方法，且提供在琼脂糖或琼脂的酶水解之后的纯化期间通过使用微生物提高3，6‑脱水‑L‑半乳糖的生产产率的效果。

A novel method for purifying 3,6-dehydrated-L-galactose by using microorganisms

The present invention relates to a novel method for purifying 3,6_dehydrated L_galactose by using microorganisms, and provides the effect of increasing the productivity of 3,6_dehydrated L_galactose by using microorganisms during purification after enzymatic hydrolysis of agarose or agar.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于通过使用微生物纯化3，6-脱水-L-半乳糖的新颖方法
本专利技术涉及一种用于使用微生物来纯化3，6-脱水-L-半乳糖的新颖方法，其通过在琼脂糖或琼脂的酶水解之后使用微生物纯化来提高3，6-脱水-L-半乳糖的生产产率。
技术介绍
构成红藻的主要多醣是琼脂糖，其为通过利用α-1，3-键和β-1，4-键使3，6-脱水-L-半乳糖(下文中称为“AHG”)与D-半乳糖交替地键连而形成的聚合物。在这些成分当中，AHG是一种具有抗龋性和结肠癌预防功能以及美化白化和保湿功能的多功能高附加值材料。因此，用于由琼脂或琼脂糖(其为红藻的主要碳水化合物)有效制备并纯化AHG的技术是非常重要的。首先制备AHG，常规地，琼胶寡糖通过用具有低浓度的弱酸、乙酸或中性缓冲剂、Tris-HCl缓冲剂(pH7.4)预处理琼脂糖或琼脂而获得，且新琼二糖(neoagarobiose)由琼胶寡糖(agarooligosaccharides)通过与外型β-琼脂水解酶II(exo-typeβ-agaraseII)的酶反应而制备。然而，此时，存在作为副产物联产琼胶三糖的缺点，且为了降解琼胶三糖，有必要引入额外的酶，如琼脂降解β-半乳糖苷酶(agarolyticβ-galactosidase；ABG)。然后，可通过α-新琼二糖水解酶(NABH)的酶反应而获得如AHG和D-半乳糖的单糖(见图1a)。然而，当在此过程的第一步骤预处理期间使用乙酸时，在后续中和步骤中产生大量的盐，且当使用低浓度的中性缓冲剂时，在高温(170℃)下执行预处理反应，且因此针对大规模生产需要高温和高压反应器。另外，在预处理期间，AHG过度降解成5-羟甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural；5-HMF)，所述5-羟甲基糠醛具有降低AHG生产产率的缺点。具体地说，因为乙酸导致腐臭气味，所以当AHG用作美化材料时，所述腐臭气味可能会成为问题。另外，因为在预处理期间，α键优先断裂，且因此必须另外使用降解作为副产物在后续酶糖化中保留的琼胶三糖(agarotriose)的ABG酶，所述过程可能更为复杂。其次，迄今为止，出于对AHG的纯化，已使用用于酶水解的最终产物(AHG以及D-半乳糖)的包含硅胶层析和生物凝胶p2管柱层析的两步骤层析。根据此方法，在硅胶层析期间使用有害有机溶剂(即二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇等)，且由于在纯化中丢失大量AHG，因而最终AHG产率降低。
技术实现思路
技术问题本专利技术是针对提供一种用于使用微生物来纯化AHG，从而利用在琼脂糖或琼脂的酶水解之后的纯化来防止在AHG生产期间由纯化所导致的AHG损失的新颖方法。本专利技术还针对提供一种用于制备AHG的组合物，其可使用上述方法来提高AHG的生产产率。技术解决方案为实现所述目标，本专利技术提供一种用于使用微生物来纯化3，6-脱水-L-半乳糖的方法，所述方法包含：使一组酶与作为基质的琼脂糖或琼脂反应，所述酶包含由阐述于SEQIDNO：1中的氨基酸序列所表示的热稳定琼脂水解酶、外型琼脂水解酶(agarase)以及α-新琼二糖水解酶；使用由以上反应所获得的产物作为碳源来培养具有代谢半乳糖的能力的微生物；以及由微生物的培养物获得3，6-脱水-L-半乳糖。本专利技术提供一种用于制备3，6-脱水-L-半乳糖的组合物，所述组合物包含：一组酶，包含由阐述于SEQIDNO：1中的氨基酸序列所表示的热稳定琼脂水解酶、外型琼脂水解酶(agarase)以及α-新琼二糖水解酶；以及微生物，具有代谢半乳糖的能力。有利效果因为在无单独常规地执行纯化过程的情况下获得AHG，所以本专利技术提供通过降低AHG损失来获得具有高产率的AHG的效果，其在不使用化学预处理、中和以及常规地执行对于琼脂糖或琼脂用琼胶三糖水解酶的处理的情况下，使用一组由以下组成的酶来使琼脂糖或琼脂降解成半乳糖和AHG：热稳定琼脂水解酶、外型琼脂水解酶以及α-新琼二糖水解酶。附图说明图1a是示出由琼脂糖通过用乙酸预处理和酶糖化以及通过根据常规技术的两步骤层析的纯化过程的AHG制备的示意图，且图1b是示出根据本专利技术的通过使用微生物糖化琼脂糖而不经预处理的AHG制备和AHG纯化过程的示意图。图2是示出由琼脂糖利用三步骤酶反应和使用根据本专利技术的微生物的AHG纯化的AHG制备的TLC结果。图3a示出在培养GRAS微生物、酵母前后的AHG纯化的TLC结果，且图3b示出在培养GRAS微生物、酵母前后的GC/MS分析结果。图4a示出通过测量引入NABH基因的重组酶的NABH活性而获得的TLC分析结果，且图4b示出测量引入NABH基因的重组酶的NABH比活性的结果。对照组表示引入空载体的酿酒酵母(Saccharomycesserevisiae)D452-2，且NABH表示引入NABH的酿酒酵母(Saccharomycesserevisiae)D452-2。图5a示出示出使用双醣、新琼二糖作为基质的时间依赖型细胞生长变化的TLC分析结果；且图5b示出示出使用双醣、新琼二糖的培养基中的时间依赖型碳源变化的TLC分析结果。对照组表示引入空载体的酿酒酵母(Saccharomycesserevisiae)D452-2，且NABH表示引入NABH的酿酒酵母(Saccharomycesserevisiae)D452-2。图6a示出使用具有D-半乳糖代谢的大肠杆菌(E.coli)的AHG纯化结果，图6b示出使用具有D-半乳糖代谢的巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)的AHG纯化结果，且图6c示出使用具有D-半乳糖代谢的运动发酵单胞菌(Z.mobilis)的AHG纯化结果。具体实施方式在下文中，将详细描述本专利技术的组合物。本专利技术提供一种用于使用微生物来纯化3，6-脱水-L-半乳糖的方法，所述方法包含：使一组酶与作为基质的琼脂糖或琼脂反应，所述酶包含由阐述于SEQIDNO：1中的氨基酸序列所表示的热稳定琼脂水解酶、外型琼脂水解酶(agarase)以及α-新琼二糖水解酶；使用由以上反应所获得的产物作为碳源来培养具有代谢半乳糖的能力的微生物；以及由微生物的培养物获得3，6-脱水-L-半乳糖。本专利技术提供一种用于制备3，6-脱水-L-半乳糖的组合物，所述组合物包含：一组酶，包含由阐述于SEQIDNO：1中的氨基酸序列所表示的热稳定琼脂水解酶、外型琼脂水解酶(agarase)以及α-新琼二糖水解酶；以及微生物，具有代谢半乳糖的能力。相比于用乙酸的常规已知预处理和用Tris-HCl缓冲剂(pH7.4)的水热预处理而再进一个步骤，为解决在涉及预处理方法的高温处理期间由AHG过度降解成5-HMF所导致的在中和里产生盐以及低糖化产率的问题，本专利技术人研发出一种用于在利用仅通过使用热稳定β-琼脂水解酶Aga16B的酶糖化来降解琼脂糖或琼脂而不使用化学预处理的情况下，通过依次使三种类型的酶(Aga16B、Aga50D、NABH)与琼脂糖或琼脂反应的从而制备具有高产率的AHG和D-半乳糖的方法。此类过程具有以下优点：1)此过程不使用昂贵的乙酸且因而降低成本。另外，在最终降解产物当中，AHG是一种可用作美化功能材料的材料且不使用导致腐臭气味的乙酸，这是AHG的最大优点中的一个。2)不产生由中和所产生的盐，如醋酸钠。3)因为不产生如5-HMF的过度本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于使用微生物来纯化3，6‑脱水‑L‑半乳糖的方法，包括：使组酶与作为基质的琼脂糖或琼脂进行反应，所述组酶包含由SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的热稳定琼脂水解酶、外型琼脂水解酶以及α‑新琼二糖水解酶；使用由以上反应所获得的产物作为碳源来培养具有代谢半乳糖的能力的微生物；以及由所述微生物的培养物获得3，6‑脱水‑L‑半乳糖。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.04.04 KR 10-2016-00410581.一种用于使用微生物来纯化3，6-脱水-L-半乳糖的方法，包括：使组酶与作为基质的琼脂糖或琼脂进行反应，所述组酶包含由SEQIDNO：1所示氨基酸序列的热稳定琼脂水解酶、外型琼脂水解酶以及α-新琼二糖水解酶；使用由以上反应所获得的产物作为碳源来培养具有代谢半乳糖的能力的微生物；以及由所述微生物的培养物获得3，6-脱水-L-半乳糖。2.根据权利要求1所述的用于使用微生物来纯化3，6-脱水-L-半乳糖的方法，其中在未预处理琼脂糖或琼脂的情况下执行所述组酶与所述基质之间的所述反应。3.根据权利要求1所述的用于使用微生物来纯化3，6-脱水-L-半乳糖的方法，其中所述组酶与所述基质之间的所述反应包含使所述热稳定琼脂水解酶与琼脂糖或琼脂进行反应，以及使由以上反应所获得的产物与所述外型琼脂水解酶及所述α-新琼二糖水解酶进行反应。4.根据权利要求3所述的用于使用微生物来纯化3，6-脱水-L-半乳糖的方法，其中所述热稳定琼脂水解酶与琼脂糖或琼脂之间的所述反应在范围介于40℃到60℃的温度下，在0rpm到300rpm以及范围介于5到9的pH的条件下执行30分钟到7天。5.根据权利要求3所述的用于使用微生物来纯化3，6-脱水-L-半乳糖的方法，其中所述外型琼脂水解酶由SEQIDNO：3的氨基酸序列表示。6.根据权利要求3所述的用于使用微生物来纯化3，6-脱水-L-半乳糖的方法，其中所述α-新琼二糖水解酶由SEQIDNO：4的氨基酸序列表...

【专利技术属性】
技术研发人员：金京宪，崔仁杰，兪素萝，尹银珠，赵庆纹，
申请(专利权)人：高丽大学校产学协力团，
类型：发明
国别省市：韩国,KR