新型HIV-1耐药检测方法的建立及其应用技术

本发明专利技术公开了一种新型HIV‑1耐药检测方法的建立及其应用。本发明专利技术建立的新型HIV‑1耐药检测方法，优点在于：①利用多套引物组合，兼顾了不同亚型毒株序列差异所造成的目的基因扩增效率低下的问题；②在一个反应管中完成了PR、RT和IN靶标基因cDNA的合成与目的基因巢式PCR的第一轮扩增，避免了分别对目的基因进行扩增，简化了实验流程，将试剂成本节约一半。本发明专利技术建立的检测方法，可同时覆盖多个毒株亚型、同时涵盖多个基因区域，使得HIV‑1耐药检测效率大大提高，对于艾滋病防治和公共卫生具有重大影响。

Establishment and Application of a New HIV-1 Resistance Detection Method

The invention discloses the establishment and application of a novel HIV 1 drug resistance detection method. The novel HIV 1 drug resistance detection method established by the invention has the advantages of: (1) taking into account the inefficiency of target gene amplification caused by the sequence differences of different subtypes of HIV strains by using multiple primer combinations; (2) completing the synthesis of PR, RT and IN target gene cDNAs and the first round amplification of target gene nested PCR in a reaction tube. The amplification avoids amplifying the target gene separately, simplifies the experimental process and saves the cost of reagent by half. The detection method established by the invention can cover multiple virus subtypes and multiple gene regions at the same time, which greatly improves the efficiency of HIV 1 resistance detection and has a significant impact on AIDS prevention and public health.

【技术实现步骤摘要】
新型HIV-1耐药检测方法的建立及其应用
本专利技术涉及一种新型HIV-1耐药检测方法的建立及其应用。
技术介绍
自1981年艾滋病发现以来，导致该疾病发生的元凶HIV(Humanimmunodeficiencyvirus,HIV)在全球迅速蔓延，先后致3,700万人感染，从而引发严重的公共卫生问题。为有效控制这一疾病的快速进展与蔓延,抗病毒治疗(Antiretroviraltherapy,ART)作为控制个体病程的措施，同时也作为管理传染源的手段用于HIV感染的预防应运而生,目前已有2,009万感染者接受了ART。从13个亚洲国家/地区治疗效果来看，ART对免疫重建起到了重要的作用，CD4细胞可从低点的115个/μL回升至302个/μL，病毒抑制率在某些地区可达到80％左右。中国目前报告存活的HIV/AIDS将近76万人(内部交流资料：2017年全国艾滋病/丙肝防治进展),全人群感染率为0.055％。为实现WHO提出的3个90％的防治目标，中国也在快速扩大治疗，已将近49万感染者接受了免费ART。免费ART在延长艾滋病患者生命(存活比例由2004的22％上升到2013年的54％)、提高生活质量和减少艾滋病的传播(单阳新发感染率从2011年的2.61％下降到2016年的0.68％)等方面均取得了长足进展(内部交流资料：2017年全国艾滋病/丙肝防治进展)。截至2017年，中国目前在治成人/儿童患者接近61万人。耐药性的出现是导致ART失败的主要原因之一，其产生是病毒、药物和宿主共同作用的结果。在药物选择压力下，HIV-1耐药毒株被筛选出来并逐渐发展成为优势毒株，从而表现为药物敏感性降低和/或病毒学反应不理想，即发生了耐药，影响了ART效果。耐药导致ART失败的报道层出不穷，如在某些开展ART地区进行的HIV-1耐药监测显示，约有50％患者经历免疫学失败，继而HIV-1耐药性毒株出现并快速流行；某些地区，针对一线药物的耐药性毒株的流行率已远超50％，并且新诊断人群传播性耐药亦呈快速上升趋势。HIV-1耐药毒株的传播与流行为艾滋病的防控也带来了前所未有的困难。相对于药物敏感性检测的金标准表型实验，基因型耐药检测具有检测周期短、成本低廉、简便易行便于推广等优点，因此在发展中国家具有很大的应用市场。当前HIV-1基因型耐药检测方法主要是针对药物靶标进行的，如已获美国FDA批准的2种HIV-1基因型耐药检测试剂ViroSeqTM与TRUGENE，检测区域为蛋白酶(Protease,PR)全长和逆转录酶(Reversetranscriptase,RT)部分区域，这些区域涵盖了所有(ProteaseInhibitors,PIs)PIs与(ReversetranscriptaseInhibitors,RTIs)RTIs的作用靶点，通过检测这些区域的基因突变及突变间的相互作用可间接评估出体内病毒对药物的耐受水平。另外不同实验室根据实验目的不同，也建立起实验室内部使用的基因型耐药检测方法，检测区域也无一例外是针对药物作用靶标的。当前获得FDA批准的HIV-1耐药检测试剂都是针对PR和RT部分靶标的，针对其他靶标的基因型耐药检测试剂由于药物使用量有限而暂时无商品化的试剂盒问世。整合酶抑制剂(IntegraseInhibitors,INSTIs)是一类面世相对较晚的新型抑制剂，该类抑制剂的优点在于：①宿主细胞内不存在与整合酶(Integrase,IN)类似的同类型酶，因此使用该抑制剂治疗时药物靶标明确，不会伤害正常细胞，因此具有较高的选择性和很好的安全性；②它与其他类抑制剂相互作用较少，因此可广泛与其他类型抑制剂配伍组成高效的抗病毒治疗方案；③该类抑制剂可迅速降低病人体内病毒，相对来说耐药屏障高、毒副作用小的优点使得患者在使用过程中能保持较好的依从性。上述特点使其在临床治疗上很受青睐，而且作为一二线药物失败的替代药物备受推崇，在抗病毒治疗失败后的补救治疗中发挥了很大的作用。尽管此类药物还未列入国家免费抗病毒药物，而在中国一二线城市中该类药物在艾滋病抗病毒治疗人群中已逾10％的患者在自费使用该类药物，而针对该类药物的耐药检测也逐渐成熟起来。虽说该类药物不易产生耐药，但也不等于其不耐药，在实际使用过程中因个体差异及治疗中差的依从性，针对INSTIs的耐药也时常发生。当前针对INSTIs的检测方法也有不断跟进与改良，但到目前为止还没有针对INSTIs耐药检测的商品化试剂盒问世。另外，INSTIs通常与PIs、RTIs一起联合使用形成高效抗病毒治疗方案，从而从多方面阻断病毒的复制进而达到抑制病毒的效果，因此当艾滋病患者出现治疗失败需要进行HIV-1耐药检测时分别对不同靶标进行检测，检测过程相对繁琐。虽说可以进行HIV-1pol区基因全场进行扩增，该区域涵盖了PR、RT及IN全长基因，是一项理想的选择。但使用该方法不足之处在于：①扩增基因片段较长(约～3153bp)，因此在cDNA合成及目的基因扩增方面效率较低(阳性率约65％)，因此不能很好满足临床治疗中耐药检测的需要；②目的基因序列的测定需要多个反应才可完成。为了确保HIV耐药检测结果的准确可靠，完成该区域的双向覆盖序列测定约需要正反8条引物测定才可以完成耐药结果的评估，因此来说测序难度较大、测序费用较高；③HIVRT药物靶标主要集中在氨基酸密码子348位之前，而后200多位密码子对抑制剂影响不是很明确，因此不作为评判耐药的主要位点，而在pol区全基因序列扩增时该区域一并扩增并进行测序，造成一定程度上的浪费；④当前使用的耐药比对数据库为斯坦福大学HIV耐药数据库(http://hivdb.stanford.edu/),该数据对提交序列长度有一定要求(＜3000bp)，因此使用pol区全长序列进行PR、RT及IN相关耐药位点比对时长度受限。不同抑制剂药物靶标分别进行扩增检测是当前比较流行的方案，该方案缺点在于：①要进行多个区段、多次cDNA的合成，价格成本较高；②核酸使用量较大，对临床检测样本及核酸纯化试剂量要求较大。如何将多个药物靶标基因区域在同一个反应管内、一次反应合成多个目的基因区域，是当前亟待解决的难题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新型HIV-1耐药检测方法的建立及其应用。本专利技术提供了引物组合，由引物组I、引物组Ⅱ和引物组Ⅲ组成；所述引物组I由引物DR1-1-CNB、引物DR2-1-CNBC、引物DR1-2-CNB、引物DR2-2-CNBC、引物pol-1e、引物pol-x、引物IN1、引物IN1-07BC、引物IN2和引物IN2-07BC组成；所述引物组Ⅱ由引物DR-3、引物DR1-4-CNB和引物DR2-4-CNBC组成；所述引物组Ⅲ由引物IN3、引物IN3-07BC、引物IN4和引物IN4-07BC组成；所述引物DR1-1-CNB为如下(a1)或(a2)；(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；所述引物DR2-1-CNBC为如下(a3)或(a4)；(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.引物组合，由引物组I、引物组Ⅱ和引物组Ⅲ组成；所述引物组I由引物DR1‑1‑CNB、引物DR2‑1‑CNBC、引物DR1‑2‑CNB、引物DR2‑2‑CNBC、引物pol‑1e、引物pol‑x、引物IN1、引物IN1‑07BC、引物IN2和引物IN2‑07BC组成；所述引物组Ⅱ由引物DR‑3、引物DR1‑4‑CNB和引物DR2‑4‑CNBC组成；所述引物组Ⅲ由引物IN3、引物IN3‑07BC、引物IN4和引物IN4‑07BC组成；所述引物DR1‑1‑CNB为如下(a1)或(a2)；(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；所述引物DR2‑1‑CNBC为如下(a3)或(a4)；(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；所述DR1‑2‑CNB为如下(a5)或(a6)；(a5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；所述引物DR2‑2‑CNBC为如下(a7)或(a8)；(a7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；(a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；所述引物pol‑1e为如下(a9)或(a10)；(a9)序列表的序列5所示的单链DNA分子；(a10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；所述引物pol‑x为如下(a11)或(a12)；(a11)序列表的序列6所示的单链DNA分子；(a12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子；所述引物IN1为如下(a13)或(a14)；(a13)序列表的序列7所示的单链DNA分子；(a14)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同功能的DNA分子；所述引物IN1‑07BC为如下(a15)或(a16)；(a15)序列表的序列8所示的单链DNA分子；(a16)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有相同功能的DNA分子；所述引物IN2为如下(a17)或(a18)；(a17)序列表的序列9所示的单链DNA分子；(a18)将序列9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列9具有相同功能的DNA分子；所述引物IN2‑07BC为如下(a19)或(a20)；(a19)序列表的序列10所示的单链DNA分子；(a20)将序列10经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列10具有相同功能的DNA分子；所述引物DR‑3为如下(a21)或(a22)；(a21)序列表的序列11所示的单链DNA分子；(a22)将序列11经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列11具有相同功能的DNA分子；所述引物DR1‑4‑CNB为如下(a23)或(a24)；(a23)序列表的序列12所示的单链DNA分子；(a24)将序列12经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列12具有相同功能的DNA分子；所述引物DR2‑4‑CNBC为如下(a25)或(a26)；(a25)序列表的序列13所示的单链DNA分子；(a26)将序列13经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列13具有相同功能的DNA分子；所述引物IN3为如下(a27)或(a28)；(a27)序列表的序列14所示的单链DNA分子；(a28)将序列14经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列14具有相同功能的DNA分子；所述引物IN3‑07BC为如下(a29)或(a30)；(a29)序列表的序列15所示的单链DNA分子；(a30)将序列15经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列15具有相同功能的DNA分子；所述引物IN4为如下(a31)或(a32)；(a31)序列表的序列16所示的单链DNA分子；(a32)将序列16经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列16具有相同功能的DNA分子；所述引物IN4‑07BC为如下(a33)或(a34)；(a33)序列表的序列17所示的单链DNA分子；(a34)将序列17经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列17具有相同功能的DNA分子。...

【技术特征摘要】
1.引物组合，由引物组I、引物组Ⅱ和引物组Ⅲ组成；所述引物组I由引物DR1-1-CNB、引物DR2-1-CNBC、引物DR1-2-CNB、引物DR2-2-CNBC、引物pol-1e、引物pol-x、引物IN1、引物IN1-07BC、引物IN2和引物IN2-07BC组成；所述引物组Ⅱ由引物DR-3、引物DR1-4-CNB和引物DR2-4-CNBC组成；所述引物组Ⅲ由引物IN3、引物IN3-07BC、引物IN4和引物IN4-07BC组成；所述引物DR1-1-CNB为如下(a1)或(a2)；(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；所述引物DR2-1-CNBC为如下(a3)或(a4)；(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；所述DR1-2-CNB为如下(a5)或(a6)；(a5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；所述引物DR2-2-CNBC为如下(a7)或(a8)；(a7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；(a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；所述引物pol-1e为如下(a9)或(a10)；(a9)序列表的序列5所示的单链DNA分子；(a10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；所述引物pol-x为如下(a11)或(a12)；(a11)序列表的序列6所示的单链DNA分子；(a12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子；所述引物IN1为如下(a13)或(a14)；(a13)序列表的序列7所示的单链DNA分子；(a14)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同功能的DNA分子；所述引物IN1-07BC为如下(a15)或(a16)；(a15)序列表的序列8所示的单链DNA分子；(a16)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有相同功能的DNA分子；所述引物IN2为如下(a17)或(a18)；(a17)序列表的序列9所示的单链DNA分子；(a18)将序列9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列9具有相同功能的DNA分子；所述引物IN2-07BC为如下(a19)或(a20)；(a19)序列表的序列10所示的单链DNA分子；(a20)将序列10经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列10具有相同功能的DNA分子；所述引物DR-3为如下(a21)或(a22)；(a21)序列表的序列11所示的单链DNA分子；(a22)将序列11经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列11具有相同功能的DNA分子；所述引物DR1-4-CNB为如下(a23)或(a24)；(...

【专利技术属性】
技术研发人员：李林，李韩平，李敬云，刘永健，韩靖婉，贾磊，李天一，鲍作义，王晓林，刘思扬，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11