miR-3942-5p作为肿瘤标志物在制备无创型泛癌诊断及预后药物中的应用制造技术

本发明专利技术通过qPCR检测miR‑3942‑5p结果显示，miR‑3942‑5p在结直肠癌、肝细胞癌、胃癌、宫颈癌及子宫内膜癌组织中较癌旁高表达，在癌症组血清中较健康及良性组均显著增高，且在转移组血清中的水平显著高于未转移组，提示miR‑3942‑5p可作为无创型泛癌诊断及预后肿瘤标志物；功能实验显示，miR‑3942‑5p可促进结肠癌细胞转移及侵袭。此外，本发明专利技术将为肿瘤筛查及预后提供新思路，并对阐明肿瘤恶性行为的分子机制具有重要意义。并且可以根据肿瘤标志物miR‑3942‑5p来开发无创型泛癌诊断及预后药物。

Application of microRNA-3942-5p as a tumor marker in the preparation of noninvasive pan-cancer diagnostic and prognostic drugs

The detection of microRNA 3942 5p by qPCR shows that microRNA 3942 5p is more highly expressed in colorectal cancer, hepatocellular carcinoma, gastric cancer, cervical cancer and endometrial cancer tissues than in adjacent cancerous tissues, significantly higher in cancer group than in healthy and benign groups, and significantly higher in metastasis group than in non-metastasis group, suggesting that microRNA is highly expressed in metastasis group. _3942_5p can be used as a non-invasive tumor marker for the diagnosis and prognosis of pan-cancer. Functional experiments show that mir_3942_5p can promote the metastasis and invasion of colon cancer cells. In addition, the present invention will provide new ideas for cancer screening and prognosis, and is of great significance to elucidate the molecular mechanism of malignant behavior of tumors. The non-invasive diagnostic and prognostic drugs for pan-cancer can also be developed based on the tumor marker Mir 3942 5p.

【技术实现步骤摘要】
miR-3942-5p作为肿瘤标志物在制备无创型泛癌诊断及预后药物中的应用
本专利技术属生物
，涉及一种用于可作为无创型泛癌诊断及预后标志物的微小非编码RNA(MicroRNA,miRNA)。
技术介绍
恶性肿瘤的发生发展是一个多因素、多步骤的生物学过程，以无限增生、浸润和转移为特征。恶性肿瘤中许多相关分子发生改变，包括经典的编码蛋白基因及最近发现的非编码RNA，非编码RNA主要包括小RNA(miRNA)和长链非编码RNA。MiRNA是一类长度约为19～25个核苷酸的非编码RNA片段，广泛存在于动植物中，它通过调节基因表达和蛋白翻译过程参与细胞增殖、分化及凋亡等生理过程。1993年，Lee等在线虫中发现第一个miRNA(lin-4)，此后大量miRNAs在动植及人类中均被发现。MiRNA作为基因表达的内源性抑制物，主要通过与mRNA的3’非编码区(UTR)结合导致翻译抑制或mRNA降解。约30％的人类编码基因受到miRNA的调控，超过50％的miRNA基因位于肿瘤相关基因组区域(称为脆性位点)，提示miRNA在人类肿瘤发生发展过程中发挥重要的调控作用。研究已证实，miRNAs在不同的肿瘤微环境下可作为癌基因或抑癌基因参与肿瘤的发生发展。一般情况下，在肿瘤中发挥癌基因作用的miRNA，如miR-17～92簇，可通过负向调控细胞凋亡相关基因的表达，引起肿瘤细胞永生化；相反，在肿瘤中发挥抑癌作用的miRNA，通常为低表达，可通过负向调节细胞增殖及周期相关基因的表达，抑制细胞增殖，加速细胞凋亡。每个miRNA能调控约100个mRNAs，导致mRNA降解或翻译抑制，而同一个mRNA也会受到多个miRNAs调控，最终形成了一个全方面、多层次、立体的调控网络。近年研究证实，作为重要的调控型分子，miRNA在肿瘤发生发展中起调控的枢纽作用。因此，通过筛选肿瘤中差异表达的miRNAs，探讨其下游分子参与肿瘤发生发展、侵袭与转移的分子机理，确定miRNAs在肿瘤恶性行为中的作用，将有利于增进我们对其癌变分子机理的理解，并为寻找特异性靶分子及高效预后分子标志物提供了可能，为肿瘤筛查与生物治疗开辟一条新的途径，具有重要的经济效益和社会价值。
技术实现思路
本专利技术通过qPCR检测miR-3942-5p结果显示，miR-3942-5p在结直肠癌、肝细胞癌、胃癌、宫颈癌及子宫内膜癌组织中较癌旁高表达，在癌症组血清中较健康及良性组均显著增高，且在转移组血清中的水平显著高于未转移组，提示miR-3942-5p可作为无创型泛癌诊断及预后肿瘤标志物；功能实验显示，miR-3942-5p可促进结肠癌细胞转移及侵袭。此外，本专利技术将为肿瘤筛查及预后提供新思路，并对阐明肿瘤恶性行为的分子机制具有重要意义。并且可以根据肿瘤标志物miR-3942-5p来开发无创型泛癌诊断及预后药物。附图说明图1为miR-3942-5p在结直肠癌组织中高表达(NT：癌旁正常组织；CRC：结直肠癌；***P＜0.001)；图2为miR-3942-5p在结直肠癌、肝细胞癌、胃癌、宫颈癌及子宫内膜癌组织中高表达(NT：癌旁正常组织；CRC：结直肠癌；HCC：肝细胞癌；GC：胃癌；CC：宫颈癌；EC：子宫内膜癌；**P＜0.01；***P＜0.001)；图3为miR-3942-5p在结直肠癌、肝细胞癌、胃癌、宫颈癌及子宫内膜癌血清中高表达(HC：健康对照；BE：良性病变；CRC：结直肠癌；HCC：肝细胞癌；GC：胃癌；CC：宫颈癌；EC：子宫内膜癌；*P＜0.05；**P＜0.01)；图4为miR-3942-5p在转移组结直肠癌血清中显著高表达(CRC-NM：非转移结直肠癌；CRC-M：转移结直肠癌；*P＜0.05)；图5为miR-3942-5p影响结肠癌细胞的体外转移及侵袭能力(NC：阴性对照；In：抑制物；Mi：模拟物；*P＜0.05；*P＜0.05；**P＜0.01)；图6为三个miRNA靶基因预测软件共同预测到292个靶基因；图7为13个靶基因的3'-UTR存在miR-3942-5p“种子序列区”的潜在结合位点；图8为SMAD7可能是miRNA3942-5p的直接靶基因。具体实施方式1、miR-3942-5p作为泛癌诊断标志物的鉴定(1)前期qPCR结果提示miR-3942-5p可作为泛癌的血清标志物。本专利技术拟分别收集12种常见的恶性肿瘤，包括结直肠癌、肝细胞癌、胃癌、宫颈癌、子宫内膜癌、肺癌、食管癌、乳腺癌、膀胱癌、鼻咽癌癌、前列腺癌及卵巢癌的血清标本数量各120例，与癌症组患者年龄及性别匹配的各良性组患者血清(预计收集120例)及健康对照血清标本(预计收集120例)分别作为良性组及健康组(高血脂、糖尿病、复合癌症及合并其他自身免疫性疾病患者的标本均不纳入该研究)。(2)提取总RNA，逆转录获得cDNA，设计特异性PCR引物，通过qPCR检测miR-3942-5p在癌症组、良性组和健康组间的表达水平差异，探究miR-3942-5p的预警功能；(3)分析上述实验结果，计算miR-3942-5p在每一种癌症诊断中的特异性及灵敏度，探究其作为泛癌血清诊断标志物的潜能；(4)分析肿瘤Ⅰ+Ⅱ分期血清中miR-3942-5p的表达水平，探究miR-3942-5p在肿瘤早期诊断中的作用。2、miR-3942-5p作为泛癌转移及预后标志物的鉴定(1)预实验结果提示miR-3942-5p可作为潜在的肿瘤转移及预后标志物。本专利技术拟收集不同临床等级的结直肠癌患者病例标本，提取总RNA，逆转录获得cDNA，设计特异性PCR引物，qPCR检测miR-3942-5p的表达水平；(2)利用统计软件分析miR-3942-5p与临床患者病理分级、TNM分期及预后情况的相关性；(3)通过对比不同病理分级及TNM分期间miR-3942-5p的表达差异，探究miR-3942-5p作为预后标志物的潜能。3、miR-3942-5p体内及体外生物学功能的鉴定(1)前期工作中，我们通过瞬时转染结合细胞功能学实验，初步证实miR-3942-5p可在体外促进结肠癌细胞的侵袭转移能力。本专利技术将通过慢病毒感染的方法构建miR-3942-5p的稳定细胞系SW480和LS174-T(过表达和沉默)；(2)通过MTT实验分别比较SW480和LS174-T细胞miR-3942-5p过表达和沉默后增殖能力的改变；(3)通过Transwell小室实验分别比较SW480和LS174-T细胞miR-3942-5p过表达和沉默后运动迁移能力的改变；(4)通过Matrigel基质胶实验分别比较SW480和LS174-T细胞miR-3942-5p过表达和沉默后侵袭能力的改变；(5)通过流式检测技术分别比较SW480和LS174-T细胞miR-3942-5p过表达和沉默后细胞周期分布的改变；(6)通过Annexin-V/PI实验分别比较SW480和LS174-T细胞miR-3942-5p过表达和沉默后细胞凋亡水平的改变；(7)通过顺铂及5-氟尿嘧啶耐药实验分别比较SW480和LS174-T细胞miR-3942-5p过表达和沉默后细胞耐药能力的改变；(8)通过构建裸鼠皮下成瘤模型，分别比较LS174-T细胞miR-3942-5p过表达本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.miR‑3942‑5p在制备无创型泛癌诊断及预后的肿瘤标志物中的应用。

【技术特征摘要】
1.miR-3942-5p在制备无创型泛癌诊断及预后的肿瘤标志物中的应用。2...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴盛明，何宝玉，刘雪香，代美玉，黄时顺，邹燕，邓开凤，莫善颖，陈晓丽，陈纪飞，
申请(专利权)人：柳州市工人医院，
类型：发明
国别省市：广西,45