一种循环肿瘤DNA低频突变的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种循环肿瘤DNA（以下简称ctDNA）低频突变的检测方法。该方法包括以下步骤：S1，从血浆中提取cfDNA；S2，对所提取的cfDNA进行末端修复和3’端加“A”；S3，对末端修复产物进行接头连接，该接头含有随机分子标签序列，同时含有用于区分不同样本的index序列；S4，对接头连接产物进行PCR扩增；S5，探针捕获目的文库；S6，通过illumina Miseq、illumina Nextseq、illumina Hiseq平台进行测序，并对下机数据进行分析。该方法适用于探针靶向捕获测序，能够降低下机数据重复率，去除PCR及测序过程中产生的错误，提高ctDNA检测灵敏度和特异性，降低假阳性率。

A Method for Detecting Low Frequency Mutations in Circulating Tumor DNA

The invention discloses a detection method for low frequency mutation of circulating tumor DNA (hereinafter referred to as ctDNA). The method includes the following steps: S1, extracting cfDNA from plasma; S2, terminal repair of extracted cfDNA and adding \A\ at 3'end; S3, joining the end repair product, which contains random molecular tag sequence and index sequence for differentiating different samples; S4, joining the joining product. Line PCR amplification; S5, probe capture target library; S6, through Illumina Miseq, Illumina Nextseq, Illumina Hiseq platform for sequencing, and analysis of the data downloaded. This method is suitable for probe targeted capture and sequencing. It can reduce the repetition rate of downloaded data, remove errors in the process of PCR and sequencing, improve the sensitivity and specificity of ctDNA detection, and reduce the false positive rate.

【技术实现步骤摘要】
一种循环肿瘤DNA低频突变的检测方法
本专利技术涉及高通量测序领域，具体而言，涉及一种循环肿瘤DNA低频突变的检测方法。
技术介绍
cfDNA是指以单链或双链DNA或DNA蛋白复合物形式存在于血液、脑脊液中的一种胞外DNA。1948年，Mandel和Metais首次发现人体血液中存在游离DNA。在肿瘤患者体内，由肿瘤细胞坏死、凋亡后释放入血液中的游离DNA片段称为循环肿瘤DNA（ctDNA）。ctDNA片段大小一般为160-180bp左右，半衰期为16min-2h不等。由于ctDNA携带了肿瘤细胞的全部变异信息，且这些基因突变仅存在于癌前细胞或癌细胞基因组中，不会在同一机体的其他正常细胞DNA中出现，因此，ctDNA相对于传统的组织学样本能够更好的体现肿瘤异质性。此外，ctDNA无需侵入性取材，只需取一管血即可检测，能够方便地监测肿瘤进程、监测靶向治疗动态。因此，基于ctDNA的肿瘤基因检测技术逐渐成为临床应用的热点，具有广泛前景。虽然ctDNA检测技术具有很大潜力，但要将其广泛应用于临床还需克服诸多障碍。首先，血液中游离DNA含量很少，平均1ml血浆中只能提取到约10ng左右总游离DNA，而ctDNA占总游离DNA比例较低，一般只有0.1%-10%。所以，低频突变位点检测是目前ctDNA检测技术遇到的一个瓶颈。其次，在高通量测序文库构建和探针捕获过程中要进行PCR反应，而PCR过程不可避免地会引入错配碱基，即使是高保真酶，其碱基错配率仍在10-6左右，并且扩增循环数越多，错误率越高。此外，目前最常用的测序仪Hiseq和Nextseq在测序过程中产生的单碱基错误率在0.01%-1%之间。因此，PCR和测序过程中产生的错误会对低频ctDNA突变检测产生强烈的背景噪音，当模板突变频率低于0.1%时，很难区分模板突变和PCR或测序过程产生的错误，导致检测特异性降低。为了提高检测灵敏度和特异性，目前最常见的做法则是提高测序深度，但由于起始cfDNA模板量量少，在后续实验过程中需要增加扩增循环数，导致下机数据重复率过高，不仅浪费了数据量，增加了成本，检测限也并没有相应地成比例提高。为了解决这一问题，学者们专利技术了一种cSMART检测技术，在每一条起始cfDNA模板3’端加上带有分子标签的测序接头，再针对特异性检测位点设计PCR下游引物，上游引物则为与测序接头相同的序列，通过多重PCR方法直接获得目的文库，在后续下机数据分析时可通过聚类分析除去PCR和测序过程中产生的错误，节约了数据量，并且使检测灵敏度达到0.03%。但该方法最大不足则在于其原理为多重PCR建库，因此只能对少量区域或位点进行检测，检测范围远远少于探针捕获测序技术。此外，目前通用的分子标签是由ATCG四种碱基随机组合而成，长度一般8-12bp，理论上四种碱基完全随机分布，但实际在引物合成过程中，由于四种碱基合成所需能量和合成效率不同，导致每个位置出现ATCG的频率并不完全一样。可能会出现连续多个相同碱基的情况，例如8个A或C，从而使实际得到的分子标签数量少于理论值。并且，连续多个相同的碱基还会增加测序错误的可能性，增加优势分子序列的比例。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的不足，本专利技术提供了一种循环肿瘤DNA低频突变的检测方法，旨在提高现有探针捕获测序法检测ctDNA低频突变的灵敏度和特异性。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术提供了一种循环肿瘤DNA低频突变的检测方法，该方法包括以下步骤：1）从血浆中提取cfDNA；2）对所提取的cfDNA进行末端修复和3’端加“A”；3）对末端修复产物进行接头连接，该接头含有随机分子标签序列，同时含有用于区分不同样本的index序列；4）对接头连接产物进行PCR扩增；5）探针捕获目的文库；6）通过illuminaMiseq、illuminaNextseq、illuminaHiseq平台进行测序，并对下机数据进行分析。上述接头序列包括下表1中SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的两条序列。其中，N表示ATCG四种碱基中任意一种，位于Index2位置上，每两个随机碱基分别由一个A或T或C或G碱基隔开，共14bp，由此可得到的随机分子标签总共有410即1048576种，每一条原始游离DNA都将连接上带有不同随机分子标签的接头。其中，(INDEX)代表由6bp碱基组成的index序列。上述PCR扩增引物为下表2中SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的两条序列。上述文库构建步骤还需用到末端修复酶及其buffer，接头连接酶及其buffer，PCR高保真聚合酶和纯化磁珠。上述探针为大于1kb的任意商业化探针或定制探针。上述探针捕获试剂为NimbleGen或IDT探针捕获试剂。上述探针捕获过程中使用的blockingoligo包括下表3中SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示的两条序列，其中SEQIDNO.6含有与所用接头中相同的index序列，合成SEQIDNO.5和SEQIDNO.6序列时，纯化方式均采用HPLA，且3’端均用InverteddT修饰。完成上述文库构建和探针捕获实验后，还应进行文库质检和qPCR文库定量，根据每个样本数据量要求，按比例进行混样，再用IlluminaMiseq/Nextseq/Hiseq测序仪上机测序，测序仪参数设置时，Index2设置14bp，Index1设置6bp。数据下机后，根据随机分子标签序列进行聚类分析，去除PCR及测序过程产生的错误数据，剩余的数据进行质控，再将质控合格的数据进行后续变异分析及注释。上述聚类分析后的标签序列进行计数时，遵循以下原则：在同一标签中80%以上reads突变则计数，一个位点在所有标签中出现2次及其以上算作阳性位点。与现有技术相比，本专利技术有以下进步和优势：1）本专利技术采用携带随机分子标签的接头，通过后续对下机数据进行特殊分析，能够排除PCR及测序过程中产生的错误，提高真阳性率。同时，在无需增加测序深度的情况下，还能降低数据重复率，提高检测灵敏度和特异性。2）本专利技术采用的分子标签接头，每隔两个随机碱基由A或T或C或G隔开，共14bp，总共有410种标签，不会降低分子标签种类，又避免了连续碱基的出现。3）目前现有的分子标签多设计在接头3’端，即与目的序列相连接位置，因此，在合成接头的两条序列3’端均需要添加分子标签，导致测序时浪费较多数据量。本专利技术采用的随机分子标签设计在Index2位置，相对而言，节约了数据量。本专利技术适用于目前肿瘤基因检测中最常见的探针捕获测序，可针对目的区域设计不同大小的探针，适用范围广。附图说明图1示出了本专利技术所提供的携带随机分子标签的接头结构图2示出了本专利技术具体实施例中5例样本探针捕获后文库经Qsep生物分析仪检测的结果。具体实施方式下面将结合实例进一步说明本专利的有益效果。实施例1采集5例肺癌患者全血各10ml，采集管使用StreckCell-FreeDNABCT®BloodCollectionTubes(10ml)，常温保存和运输，时间不超过72h。采用两步法分离血浆，先将全血1600g室温离心10min，取出约4.5ml上清于15ml离心管中，再16000g4℃离心10min，取出约4ml上清，分装于本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种ctDNA低频突变的检测方法，其特征在于，所使用的接头由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的两条序列退火而成；所述SEQ ID NO.1含有随机分子标签序列，该随机分子标签序列长14bp，序列为NNANNTNNCNNGNN，位于Index2位置上，其中，N表示ATCG四种碱基中任意一种，每两个随机碱基分别由一个A或T或C或G碱基隔开；所述SEQ ID NO.2序列含有用于区分不同样本的index序列，该index序列长6bp，由ATCG四种碱基组成。

【技术特征摘要】
1.一种ctDNA低频突变的检测方法，其特征在于，所使用的接头由SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的两条序列退火而成；所述SEQIDNO.1含有随机分子标签序列，该随机分子标签序列长14bp，序列为NNANNTNNCNNGNN，位于Index2位置上，其中，N表示ATCG四种碱基中任意一种，每两个随机碱基分别由一个A或T或C或G碱基隔开；所述SEQIDNO.2序列含有用于区分不同样本的index序列，该inde...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘青青，谢文龙，曾缘欢，陈荣山，李宇，温恒斌，肖辛野，姚迅，李奇渊，李晓哲，
申请(专利权)人：厦门基源医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：福建,35