一种牛冻精X、Y精子分离方法技术

本发明专利技术属于牛冻精生产技术领域，具体涉及一种牛冻精X、Y精子分离方法，包括配置Staining液和稀释液，Staining液中各成分及其终浓度为：Hepes：9.520g/L，MgCl2·6H2O：0.08g/L，NaCl：5.518g/L，KCl：0.224g/L，Na2HPO4：0.04g/L，NaHCO3：0.84g/L，Napy：0.22g/L，葡萄糖：0.90g/L，Nalatctate：3.61ml/L，BSA：3.0g/L，庆大霉素：2.5ml/L；将牛冷冻冻精解冻，解冻后离心，弃上清液，计算沉淀精子数量；用Staining液将沉淀精子稀释至浓度为1×10

A Separation Method of X and Y Sperms from Bovine Frozen Sperm

The invention belongs to the technical field of Bovine Frozen Semen production, and specifically relates to a method for separating Bovine Frozen Semen X and Y sperm, including the configuration of Staining solution and dilution solution, the components and final concentration of Staining solution are: Hepes: 9.520g/L, MgCl2.6H_2O: 0.08g/L, NaCl: 5.518g/L, KCl: 0.224g/L, Na2HPO_4:0.04g/L, NaHCO_3:0.84g/L, Na Py: 0.22g/L, glucose: 0.90g/L, Nalatctate: 3.61ml/L, BSA: 3.0g/L, gentamicin: 2.5ml/L; bovine frozen semen was thawed, centrifuged after thawing, supernatant was discarded, and the number of precipitated sperm was calculated; the precipitated sperm was diluted to 1*10 concentration with Staining liquid.

【技术实现步骤摘要】
一种牛冻精X、Y精子分离方法
本专利技术属于牛冻精生产
，具体涉及一种牛冻精X、Y精子分离方法。
技术介绍
在牛的养殖生产中，有选择地繁殖出具有预知性别的牛后代将能大大提高牛生产的速度和效率，用X或Y精子给母牛授精，在受精之前便可决定后代的性别，从而显著地改变后代的性别比例，达到性别控制的目的。目前，只有流式细胞仪精子分离法被公认为最科学最可靠，同时也是最高效的精子分离方法。流式细胞仪分离哺乳动物X、Y精子是根据哺乳动物X精子的DNA含量比Y精子多的原理，荧光染色之后通过分辨荧光差别将二者分开，受精之后达到性别控制的目的。但是目前针对X、Y精子采用流式细胞仪所采用的分离手段如CN1667118A中所述“在采集的公畜原精液中加入抗生素混合溶液，24小时内恒温保存，用不含卵黄的精子稀释液将原精液稀释后加入荧光染色剂、并在水浴锅中孵育染色，水浴结束后加入色素，在恒温下利用流式细胞仪分离所需的X或Y精子，用预装有含卵黄的精子接受液的试管收集分离后的X精子和Y精子，分离得到的精液经离心浓缩后可直接用于人工授精或体外授精，或低温平衡后冷冻保存。”该种方法所采用的原精液为鲜精，且要求鲜精密度在8亿精子/ml以上且活力≥0.6，如果需要引进国外的所需的X或Y精子，需要引进活体牛或者引进胚胎或者是引进性控胚胎，此种方法所需费用较高，无法满足国内市场的需求。
技术实现思路
针对上述现有技术存在的不足之处，本专利技术的目的就在于提供一种操作简单、费用低且可适用于冻精性控分离X、Y精子的方法。本专利技术通过以下技术方案来实现上述目的：一种牛冻精X、Y精子分离方法，包括如下步骤：步骤(1)配置Staining液和稀释液1.1)Staining液Staining液中各成分及其终浓度为：Hepes：9.520g/L，MgCl2·6H2O：0.08g/L，NaCl：5.518g/L，KCl：0.224g/L，Na2HPO4：0.04g/L，NaHCO3：0.84g/L，Napy：0.22g/L，葡萄糖：0.90g/L，Nalatctate：3.61ml/L，BSA：3.0g/L，庆大霉素：2.5ml/L；1.2)稀释液稀释液包括796份工作液、204份蛋黄，以及终浓度为0.007467ml/ml庆大霉素、终浓度为0.005633ml/ml的抗生素泰勒菌素和林肯霉素，所述的工作液中各成分及其终浓度为：Tris30.44g/L，柠檬酸17.21g/L，果糖12.65g/L；步骤(2)将牛冷冻冻精解冻，解冻后离心，弃上清液，计算沉淀精子数量；步骤(3)用Staining液将步骤(2)所得的沉淀精子稀释至浓度为1×108个精子/ml，然后加入荧光染料，混合均匀后置于水浴中静置，水浴后用流式细胞仪使X、Y精子分离，将X或Y精子置于冰箱中平衡，平衡后离心，弃上清液，收集沉淀X或Y精子，向X或Y精子中加稀释液后冷冻保存。优选地，上述牛冻精X、Y精子分离方法，步骤1.1)中Staining液的配置方法为：将700-800ml的超纯水倒入烧杯中，开启搅拌，分别依次加入Hepes、MgCl2·6H2O、NaCl、KCl、Na2HPO4、NaHCO3、Napy、葡萄糖、Nalatctate和BSA摇匀后，采用NaOH溶液调节PH值至7.4，将烧杯中的溶液转移至容量瓶，添加超纯水定容至1000ml，封膜摇匀；将容量瓶中的液体静置24h后过滤，滤液置于试剂瓶中，待用；在使用前向试剂瓶中加入终浓度为2.5ml/L的庆大霉素。优选地，上述牛冻精X、Y精子分离方法，步骤1.2)中，配置稀释液包括如下步骤：(1)配置工作液工作液的配置方法为在烧杯中加入700-800ml超纯水，开启搅拌，并依次加入Tris、柠檬酸和果糖，溶解后采用NaOH溶液调节PH至6.80，将烧杯中的溶液转移至容量瓶，添加超纯水定容至1000ml，混合均匀后过滤，弃滤渣，将滤液在4℃条件保存备用，(2)配置稀释液称取796ml工作液置于1000ml容量瓶中，并向容量瓶中加入204ml蛋黄，摇匀后放置24小时，将容量瓶中溶液离心过滤三次，然后按终浓度为0.005633ml/ml分别加入抗生素成品泰勒菌素和林肯霉素，终浓度为0.007467ml/ml加入庆大霉素，混合均匀，即制得稀释液。优选地，上述牛冻精X、Y精子分离方法，步骤(2)中，所述的牛冷冻冻精为活力大于或等于0.35的液氮保存下的冷冻冻精。优选地，上述牛冻精X、Y精子分离方法，步骤(2)中，所述的解冻条件为将牛冷冻冻精置于38℃的水浴中解冻10s。优选地，上述牛冻精X、Y精子分离方法，步骤(2)中，所述的离心操作为将牛冷冻冻精解冻后剪掉盛装牛冷冻冻精的细管的非棉塞端，用推针从棉塞端将解冻后的冻精精液推至离心管中，在18℃、850G条件下离心10分钟，离心后弃上清液。优选地，上述牛冻精X、Y精子分离方法，步骤(3)中，所述的荧光染料为H33342。优选地，上述牛冻精X、Y精子分离方法，步骤(3)中，所述的水浴温度为34℃，水浴时间为48分钟。优选地，上述牛冻精X、Y精子分离方法，步骤(3)中，将X或Y精子置于冰箱中平衡，冰箱中的温度控制在4℃，平衡后离心时离心温度控制在4℃，离心力控制在850G，离心时间控制在20min，离心后用稀释液稀释，稀释后置于4℃条件下保存。优选地，上述牛冻精X、Y精子分离方法，步骤(2)中，所述的计算沉淀所含精子数量所采用的方法为血细胞计数板计数法。优选地，上述牛冻精X、Y精子分离方法，步骤1.1)中搅拌时采用的搅拌器为磁力搅拌器。优选地，上述牛冻精X、Y精子分离方法，步骤1.1)中所用的NaOH为质量分数为15％的NaOH溶液。本申请文件中所述的Hepes的中文全称：4-羟乙基哌嗪乙磺酸；N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸，Napy的中文全称为：丙酮酸钠，Nalatctate的中文全称为：乳酸钠。本申请文件中所述的BSA的中文全称为牛血清白蛋白；本申请文件中所述的抗生素泰勒是指泰勒菌素，抗生素泰勒的配置方法为将0.76g酒石酸泰勒菌素(Tylosintartrate)与40ml2.9％(质量分数，下同)柠檬酸钠混合均匀即制得抗生素泰勒；本申请文件中所述的抗生素林肯是指林肯霉素，抗生素林肯的配置方法为：以壮观霉素(Spectinomycindihydrochloridepentahydrate)∶林肯霉素(Lincomycinhydrochloride)∶2.9％柠檬酸钠的比例为4g∶2g∶40ml配置而成的混合液为抗生素林肯。与现有技术相比较，本专利技术所述的牛冻精X、Y精子分离方法具有如下创新点：本专利技术提供的牛冻精X、Y精子分离方法，通过合理的配置Staining液和稀释液使冻精也可以采用流式细胞仪实现分离，现有的流式细胞仪仅限于鲜精且要求鲜精密度在8亿精子/ml且要求活力大于等于0.6，本专利技术所提供的牛冻精X、Y精子分离方法仅两剂冷冻冻精(冻精密度≥8000万个精子/ml，冻精规格：0.25ml/剂)就可以满足所需要的精子量。且分离后的精子活力达到0.3-0.36，性别控制率≥90％，最高可达99％，完全可以满足体外受精所需要的条件。具体实施方式为了使本
的人员更好地理解本专利技术方案，下面结合具本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种牛冻精X、Y精子分离方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤(1)配置Staining液和稀释液1.1)Staining液Staining液中各成分及其终浓度为：Hepes：9.520g/L，MgCl2·6H2O：0.08g/L，NaCl：5.518g/L，KCl：0.224g/L，Na2HPO4：0.04g/L，NaHCO3：0.84g/L，Napy：0.22g/L，葡萄糖：0.90g/L，Nalatctate：3.61ml/L，BSA：3.0g/L，庆大霉素：2.5ml/L；1.2)稀释液稀释液包括796份工作液、204份蛋黄，以及终浓度为0.007467ml/ml庆大霉素、终浓度为0.005633ml/ml的抗生素泰勒菌素和林肯霉素，所述的工作液中各成分及其终浓度为：Tris 30.44g/L，柠檬酸17.21g/L，果糖12.65g/L；步骤(2)将牛冷冻冻精解冻，解冻后离心，弃上清液，计算沉淀精子数量；步骤(3)用Staining液将步骤(2)所得的沉淀精子稀释至浓度为1×108个精子/ml，然后加入荧光染料，混合均匀后置于水浴中静置，水浴后用流式细胞仪使X、Y精子分离，将X或Y精子置于冰箱中平衡，平衡后离心，弃上清液，收集沉淀X或Y精子，向X或Y精子中加稀释液后冷冻保存。...

【技术特征摘要】
1.一种牛冻精X、Y精子分离方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤(1)配置Staining液和稀释液1.1)Staining液Staining液中各成分及其终浓度为：Hepes：9.520g/L，MgCl2·6H2O：0.08g/L，NaCl：5.518g/L，KCl：0.224g/L，Na2HPO4：0.04g/L，NaHCO3：0.84g/L，Napy：0.22g/L，葡萄糖：0.90g/L，Nalatctate：3.61ml/L，BSA：3.0g/L，庆大霉素：2.5ml/L；1.2)稀释液稀释液包括796份工作液、204份蛋黄，以及终浓度为0.007467ml/ml庆大霉素、终浓度为0.005633ml/ml的抗生素泰勒菌素和林肯霉素，所述的工作液中各成分及其终浓度为：Tris30.44g/L，柠檬酸17.21g/L，果糖12.65g/L；步骤(2)将牛冷冻冻精解冻，解冻后离心，弃上清液，计算沉淀精子数量；步骤(3)用Staining液将步骤(2)所得的沉淀精子稀释至浓度为1×108个精子/ml，然后加入荧光染料，混合均匀后置于水浴中静置，水浴后用流式细胞仪使X、Y精子分离，将X或Y精子置于冰箱中平衡，平衡后离心，弃上清液，收集沉淀X或Y精子，向X或Y精子中加稀释液后冷冻保存。2.根据权利要求1所述的牛冻精X、Y精子分离方法，其特征在于，步骤1.1)中Staining液的配置方法为：将700-800ml的超纯水倒入烧杯中，搅拌，分别依次加入Hepes、MgCl2·6H2O、NaCl、KCl、Na2HPO4、NaHCO3、Napy、葡萄糖、Nalatctate和BSA摇匀后，采用NaOH溶液调节PH值至7.4，将烧杯中的溶液转移至容量瓶，添加超纯水定容至1000ml，封膜摇匀；将容量瓶中的液体静置24h后过滤，滤液置于试剂瓶中，待用；在使用前向试剂瓶中加入终浓度为2.5ml/L的庆大霉素。3.根据权利要求1所述的牛冻精X、Y精子分离方法，其特征在于，步骤1.2)中，配置稀释...

【专利技术属性】
技术研发人员：生卫东，徐美芳，贺亚南，陈志南，张志鹏，田全召，
申请(专利权)人：河南省鼎元种牛育种有限公司，
类型：发明
国别省市：河南,41