一种精原干细胞体外无饲养层长期培养方法技术

本发明专利技术为一种精原干细胞体外无饲养层长期培养方法，其通过筛选不同的细胞外基质以及将化学小分子物质应用于猪的精原干细胞长期培养，在体外可将猪的精原干细胞培养至三个月。本发明专利技术以2D赛天然人工合成多肽基质涂层作为一种胞外基质，在培养过程中观察到典型的葡萄串珠状精原干细胞簇，对不同的化学小分子组合进行筛选，通过添加Chir99021，Repsox以及CD脂质浓缩物，将猪的精原干细胞体外培养至三个月并维持较好精原干细胞特性。

【技术实现步骤摘要】
一种精原干细胞体外无饲养层长期培养方法
本专利技术属于细胞工程
，特别涉及一种精原干细胞体外无饲养层长期培养方法。
技术介绍
中国是世界上养猪最多的国家之一，由于猪与人的亲缘关系近，其生理生化指标与人类相似，因而经常被用来研究人类的生殖发育机制。精原干细胞(spermatogonialstemcells,SSC)是哺乳动物体内唯一可以将遗传信息传递给下一代的成体干细胞。在早期研究中，SSCs一直被认为是单能的，而实际上SSC在培养过程中能够自主重编程形成ES样多潜能干细胞，尽管自发重编程的效率相对较低，因此，精原干细胞也被认为是一种多潜能细胞的理想来源，其可以向多种细胞类型分化，包括平滑肌细胞、血管内皮细胞、卵母样细胞、肝干细胞样细胞、肾实质细胞、神经元样细胞、神经上皮样细胞等。如今，体外培养小鼠以及一些别的物种的精原干细胞已经实现。1998年，Brinster等首次报道了关于精原干细胞的长期培养，研究表明，过表达GDNF会使精原细胞快速增殖，而干扰GDNF则会使精原细胞数量减少，这项发现随后迅速促进了精原干细胞培养基的优化与筛选。筛选行之有效的精原干细胞体外培养体系对于研究精子发生相关的作用机制必不可少。截止到目前，已报道的主要有四种小鼠精原干细胞的培养体系，而猪等家养动物长期培养SSCs的稳定体系还没有建立，特别是当SSCs进行无饲养层培养时。猪作为一种重要的模式动物，建立和完善猪精原干细胞(pSSC)的培养体系非常重要。已有的精原干细胞长期培养体系并不能完全实现猪精原干细胞的体外长期培养，因此我们需要优化pSSCs的体外培养体系，为探索其生物学特性奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种精原干细胞体外无饲养层长期培养方法，其通过筛选不同的细胞外基质以及将化学小分子物质应用于猪的精原干细胞长期培养，在体外可将猪的精原干细胞培养至三个月。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种精原干细胞体外无饲养层长期培养方法，其特征在于：以2D赛天然人工合成多肽基质涂层作为一种胞外基质，在培养过程中观察到典型的葡萄串珠状精原干细胞簇，将猪的精原干细胞体外培养至两个月并维持较好精原干细胞特性。一种精原干细胞体外无饲养层长期培养方法，其特征在于：以2D赛天然人工合成多肽基质涂层作为一种胞外基质，在培养过程中观察到典型的葡萄串珠状精原干细胞簇，对不同的化学小分子组合进行筛选，通过添加Chir99021，Repsox以及CD脂质浓缩物，将猪的精原干细胞体外培养至三个月并维持较好精原干细胞特性。所述的的2D赛天然人工合成多肽基质涂层为一种商品化的人工合成的多肽，应用于猪的精原干细胞的无饲养层培养。一种精原干细胞体外无饲养层长期培养方法，其特征在于包括以下步骤：1)猪睾丸原代细胞的分离：采用两步酶消化法，经连续两次差异贴壁，通过多能性干细胞染料CDy1对分离富集得到的猪精原干细胞鉴定；2)精原干细胞的培养与传代：当猪的精原干细胞生长密度达到80-90％时，进行传代，首先，轻柔操作，弃去原培养液，随后用PBS清洗一次，加入1-1.5mL0.25％的胰蛋白酶于37℃消化3-5min，取出后用高糖DMEM(10％FBS)终止消化，轻柔吹打之后收集细胞悬液于离心管中，1200rpm离心5min，随后用配制好的猪精原干细胞培养液重悬，接种于预先处理好的细胞培养板。所述的细胞培养板处理方法为：多聚赖氨酸包被培养皿至少4h，之后将培养板用PBS洗两次并自然干燥。明胶(0.1％)包被培养皿1h，随后用PBS洗涤一次待用。层粘连蛋白包被的平板(10μL/mL)1h。10μL/mL层粘连蛋白包被培养皿1h后，接种细胞。2D赛天然试剂盒含有组分A和B。培养板孔中加入液体A温育10min。吸出液体A后，加入成分B，温育1h备用。猪精原干细胞的培养液的配制方法为：DM/F12基础液用于配制500mL完全培养基，加入10％KSR,1％NEAA，5％FBS,0.1％的β-巯基乙醇(1000×)，1％的L-谷氨酰胺浓缩液(100×)，用磁力搅拌器充分混匀后，于0.22μm的滤器过滤除菌，分装于20/50mL的瓶中，4℃保存，每次使用前依次加入LIF，bFGF，EGF，GDNF；所述的各因子终浓度均为20ng/mL。一种精原干细胞体外无饲养层长期培养方法，其特征在于具体包括以下操作：1)50mL离心管中加入PBS(双抗100X)，放置于冰盒中，75％酒精清洗猪睾丸一次，随后用添加双抗的PBS洗两次，剪去附睾，脂肪等，接着剪去白膜，中间多次更换手术器械，留下一部分样品用PFA固定用于包埋切片，剩余睾丸组织于玻璃60皿中剪碎，添加适量Ⅳ型胶原酶(2mg/mL),待组织剪至细腻且无肉眼可见组织块时，加入1:1:1的Ⅳ型胶原酶(2mg/mL)；Dnase(20μg/mL)；Dispase(2mg/mL)，37℃培养箱消化，中途多次摇晃，15min后取出，用枪头挑一挑，至不再粘稠，转移至50mL离心管中，并加入约30mLPBS，颠倒混匀之后自然沉降5min，肉眼可见底部粉色组织块沉淀，将除组织块之外的液体转移至新的离心管，300g离心5min，弃上清，用PBS将底部白色曲细精管反复清洗离心两次，以除去间质细胞及红细胞，随后加入5mL胰蛋白酶，吹打混匀，37℃培养箱消化5min，取出后，用20μL移液枪取一滴于培养皿中，镜检，当观察到80％以上曲细精管已消化开时，终止消化(血清或者等体积完全培养液)，离心弃上清，完全培养液重悬，即可接种培养皿，随后每隔两小时进行一次差异贴壁，连续两次，进行猪精原干细胞培养。2)从第60d时即加入各种化学小分子组合，涉及的小分子包括：Chir99021(C)，REPSOX(R)，AM580(A)，SGC0946(S)，VC(V)，叶酸(F)以及脂质(L)，总共包括六个实验组，分别为：CR(Chir99021，REPSOX)；CRAS(Chir99021，REPSOX，AM580，SGC0946)；CRV(Chir99021，REPSOX，VC)；CRF(Chir99021，REPSOX，叶酸)；CRL(Chir99021，REPSOX，Lipid)和CRASF(Chir99021，REPSOX，AM580，SGC0946，叶酸)组，每天半量换液，均采用TrypLE(Gibco)消化细胞。第一代后，每隔3-6d，将细胞继传代并在24孔板中培养，每组重复三次。3)PKH26标记猪精原干细胞进行异种移植：胰蛋白酶消化细胞，将2×107个细胞加入15mL离心管中，以400×g离心5min；去除上清液，保证细胞块中剩余的液体少于25μL；加入1mL稀释液C，标记前，准备4×10-6M的PKH26染料(用稀释剂C稀释)并置于离心管中，然后尽快将1mL细胞加入到1mL染料中，并立即将样品进行吹打混合，之后于25℃孵育2min，加入等体积血清终止反应，孵育1min，细胞400×g，25℃离心10min，随后将细胞转移至新管中并洗涤三次，保证无多余染料残留，离心，重新悬浮；用载玻片，滴加一滴于荧光显微镜下检测标记效率。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益的技术效果：1)本专利技术通过筛选不同的细胞外基质后，使用2D赛天然作为细胞培养基质本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种精原干细胞体外无饲养层长期培养方法，其特征在于：以2D赛天然人工合成多肽基质涂层作为一种胞外基质，在培养过程中观察到典型的葡萄串珠状精原干细胞簇，将猪的精原干细胞体外培养至两个月并维持较好精原干细胞特性。

【技术特征摘要】
1.一种精原干细胞体外无饲养层长期培养方法，其特征在于：以2D赛天然人工合成多肽基质涂层作为一种胞外基质，在培养过程中观察到典型的葡萄串珠状精原干细胞簇，将猪的精原干细胞体外培养至两个月并维持较好精原干细胞特性。2.根据权利要求1所述的一种精原干细胞体外无饲养层长期培养方法，其特征在于：以2D赛天然人工合成多肽基质涂层作为一种胞外基质，在培养过程中观察到典型的葡萄串珠状精原干细胞簇，对不同的化学小分子组合进行筛选，通过添加Chir99021，Repsox以及CD脂质浓缩物，将猪的精原干细胞体外培养至三个月并维持较好精原干细胞特性。3.根据权利要求1或2所述的一种精原干细胞体外无饲养层长期培养方法，其特征在于：所述的2D赛天然人工合成多肽基质涂层为一种商品化的人工合成的多肽，应用于猪的精原干细胞的无饲养层培养。4.根据权利要求3所述的一种精原干细胞体外无饲养层长期培养方法，其特征在于包括以下步骤：1)猪睾丸原代细胞的分离：采用两步酶消化法，经连续两次差异贴壁，通过多能性干细胞染料CDy1对分离富集得到的猪精原干细胞鉴定；2)精原干细胞的培养与传代：当猪的精原干细胞生长密度达到80-90％时，进行传代，首先，轻柔操作，弃去原培养液，随后用PBS清洗一次，加入1-1.5mL0.25％的胰蛋白酶于37℃消化3-5min，取出后用高糖DMEM(10％FBS)终止消化，轻柔吹打之后收集细胞悬液于离心管中，1200rpm离心5min，随后用配制好的猪精原干细胞培养液重悬，接种于预先处理好的细胞培养板。5.根据权利要求4所述的一种精原干细胞体外无饲养层长期培养方法，其特征在于：所述的细胞培养板处理方法为：多聚赖氨酸包被培养皿至少4h，之后将培养板用PBS洗两次并自然干燥。明胶(0.1％)包被培养皿1h，随后用PBS洗涤一次待用。层粘连蛋白包被的平板(10μL/mL)1h。10μL/mL层粘连蛋白包被培养皿1h后，接种细胞。2D赛天然试剂盒含有组分A和B。培养板孔中加入液体A温育10min。吸出液体A后，加入成分B，温育1h备用。6.根据权利要求5所述的一种精原干细胞体外无饲养层长期培养方法，其特征在于：猪精原干细胞的培养液的配制方法为：DM/F12基础液用于配制500mL完全培养基，加入10％KSR,1％NEAA，5％FBS,0.1％的β-巯基乙醇(1000×)，1％的L-谷氨酰胺浓缩液(100×)，用磁力搅拌器充分混匀后，于0.22μm的滤器过滤除菌，分装于20/50mL的瓶中，4℃保存，每次使用前依次加入LIF，bFGF，EGF，GDNF；所述的各因子终浓度均为20ng/mL。7.根据权利要求6所述的一种精原干细胞体外无饲养层长期培养方法，其特征在于包括以下...

【专利技术属性】
技术研发人员：华进联，张莹，周哲，沈巧燕，祝振硕，李娜，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61