一种提高牛性控冻精体外受精能力的方法技术

本发明专利技术提出了花青素和吡咯喹啉醌在提高性控冻精体外受精能力方面的用途，并提出了添加花青素和吡咯喹啉醌的洗精液和受精液。本发明专利技术在牛性控冻精解冻、获能过程中，向洗精液和受精液中分别都加入花青素和吡咯喹啉醌，来处理牛性控冻精，而后进行体外受精。结果表明，牛性控精液的卵裂率、囊胚率得到显著性提高，并显著超过了同头公牛未分离冻精的体外受精效率，具有广泛的应用前景，值得推广。

【技术实现步骤摘要】
一种提高牛性控冻精体外受精能力的方法
本专利技术涉及人工体外受精领域，具体涉及一种提高性控冻精体外受精能力的方法。
技术介绍
在养殖业中，性别控制技术能够使人们获得预期性别的后代，进而提高养殖业效益和育种进度，因此该技术具有十分重要的意义。Johnson等在1989年开发的精子流式细胞仪分离技术，已经被成功用于奶牛X、Y精子的分离。目前，在奶牛人工授精过程中采用性控冻精，可控制母牛出生率在90％以上(MikkolaM,AnderssonM,TaponenJ.Transferofcattleembryosproducedwithsex-sortedsemenresultsinimpairedpregnancyrateandincreasedmalecalfmortality[J].Theriogenology,2015,84(7):1118-22.)。然而，青年牛采用奶牛性控冻精人工授精后受胎率约为40％，远低于常规冻精(70％左右)(郝海生,赵明礼,朱化彬等.性控冷冻精液人工授精对青年奶牛繁殖性能的影响[J].畜牧与兽医,2016,48(8):52-54.)。同时，奶牛性控冻精用于体外受精时，卵裂率通常为40％、囊胚率为10％左右，而常规冻精体外受精后卵裂率通常在80％、30％以上(ZhaoXM,RenJJ,ZhaoSJ,etal.Apoptosis-likeeventsandinvitrofertilizationcapacityofsex-sortedbovinesperm[J].ReprodDomestAnim,2014,49(4):543-549.)。研究表明，在性控精子分离过程中，需要经过稀释、染色、激光照射、冷冻等步骤，导致性控精子受精能力降低。因此，如何提高性控冻精活力和受精能力，已经成为该领域的研究热点。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中性控冻精受精能力降低的问题，提供一种在性控冻精解冻、获能过程中的保护措施，以保护性冻精免受ROS的影响，进而提高牛性控冻精活力和体外受精的方法。本专利技术的一个目的是提供花青素和吡咯喹啉醌在提高性控冻精体外受精能力的用途。本专利技术的另一个目的是提供一种受精液，该受精液溶液中还含有花青素和吡咯喹啉醌。本专利技术的另一个目的是提供一种洗精液，该洗精精液溶液中还含有花青素和吡咯喹啉醌。最后，本专利技术还提供一种利用含有花青素和吡咯喹啉醌的洗精液和受精液处理性控冻精，从而提高性控冻精体外受精能力的方法。具体的说，本专利技术所述的性控冻精是牛性控冻精。进一步的，本专利技术所述的洗精液可采用本领域常用的各种洗精液加入花青素和吡咯喹啉醌。其中花青素的浓度为10-5M-10-1M，所述吡咯喹啉醌的浓度为50μM-5mM；优选的，所述花青素的浓度为10-3M，所述吡咯喹啉醌的浓度为500μM。进一步优选的，所述洗精液是BO液+3.38mg/mL咖啡因，还含有浓度为10-5M-10-1M的花青素，以及浓度为50μM-5mM的吡咯喹啉醌。更进一步优选的，所述洗精液中花青素的浓度为10-3M，所述吡咯喹啉醌的浓度为500μM。另外，本专利技术所述的受精液可采用本领域常用的各种受精液加入花青素和吡咯喹啉醌。其中，花青素的浓度为10-5M-10-1M，所述吡咯喹啉醌的浓度为50μM-5mM；优选的，所述花青素的浓度为10-3M，所述吡咯喹啉醌的浓度为500μM。进一步优选的，所述洗精液为：BO液+20mg/mL肝素钠+20mg/mLBSA，还含有浓度为10-5M-10-1M的花青素，以及浓度为50μM-5mM的吡咯喹啉醌；更进一步优选的，所述受精液中花青素的浓度为10-3M，所述吡咯喹啉醌的浓度为500μM。本专利技术还提供一种提高性控冻精体外受精能力的方法，特别的，该方法包括将性控冻精采用含有花青素和吡咯喹啉醌的洗精液和受精液处理的步骤。具体的说，本专利技术所述的方法，包括如下步骤：(1)取性控冻精，解冻；(2)将步骤(1)中的解冻的性控冻精采用含有花青素和吡咯喹啉醌的洗精液洗涤；(3)将步骤(2)中得到的洗涤后的性控冻精采用含有花青素和吡咯喹啉醌的受精液处理后备用。其中，步骤(2)中洗涤次数为2次。其中，步骤(3)中的处理时间为1.5小时。一般来说，所述处理是将性控冻精放置在所需溶液中静置即可。牛性控精液采用洗精洗涤2次，进而在受精液中获能1.5小时，而后进行体外受精。应用结果表明，牛性控精液的卵裂率、囊胚率得到显著性提高，并显著超过了同头公牛未分离冻精的体外受精效率，具有广泛的应用前景，值得推广。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。1.基础液体配制(1)卵母细胞洗涤液3.58g/L4-羟乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)+10％TCM199(10×)+0.22g/L丙酮酸钠+10mg/L肝素+0.168g/LNaHCO3+20mL/LFBS+146mg/L谷氨酰胺。(2)卵母细胞体外成熟液TCM199(1×)+0.01IU/mLFSH+10μg/mL肝素钠+40ng/mLIGF+50ng/mLEGF+0.01IU/mLLH+1μg/mLE2+10％FBS。(3)体外受精液参照Brackett和Oliphant(1975)描述的方法进行配制。基础液(BO液)：0.3mg/mLKCl+6.55mg/mLNaCl+0.33mg/mLCaCl2·2H2O+106mg/mLMgCl2·6H2O+99μg/mLNaH2PO4+3.10mg/mLNaHCO3+2.5mg/mL葡萄糖+138μg/mL丙酮酸钠+3mg/mLBSA。洗精液：BO液+3.38mg/mL咖啡因。受精液：BO液+20mg/mL肝素钠+20mg/mLBSA。用0.22μm滤膜对配好的洗精液和受精液进行过滤灭菌后，4℃冰箱保存。2.精液处理冻精从液氮中取出后，快速运动使其表面液氮挥发完毕，而后投入37℃温水中解冻。精液先用洗精液1800r/min离心洗涤2次，每次5min。弃掉上清后，精子沉淀再加入受精液重悬，调整精子密度5×106个/mL。吸取20μL精液放入提前预热的80μL受精中。放入恒温培养箱孵育1.5h后用于后续检测。3.精子ROS水平分析精子采用10μmol/L1μLDCFH-DA避光孵育20min，1500r/min离心洗涤5min后，加入100μLPBS重悬沉淀。吸取部分精子悬浮液，压片后置于荧光显微镜下照相。采用图像分析软件ImageJ分析精子头部ROS水平。4.精子凋亡检测按照AnnexinV-FITC/PI试剂盒(Roche公司，瑞士)说明书方法检测精子PS外翻。先取处理好的精液，1500r/min离心3min，弃上清，FITC结合液重悬，调整精液密度为2.5×105个/mL。将精液分4组试验：(1)对照组：200μLFITC结合液重悬精液，不染色；(2)AnnexinV-FITC单染组：取195μL结合液重悬的精液，加入5μLAnnexinV-FITC，轻轻混匀，室温(20～25℃)避光孵育10min；(3)PI单染组：190μL结合液重悬精液，加入10μLPI染色液，轻轻本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.花青素和吡咯喹啉醌在处理性控冻精，从而提高性控冻精体外受精能力的用途。

【技术特征摘要】
1.花青素和吡咯喹啉醌在处理性控冻精，从而提高性控冻精体外受精能力的用途。2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述性控冻精是牛性控冻精。3.一种受精液，其特征在于，所述受精液溶液中还含有花青素和吡咯喹啉醌。4.如权利要求3所述的受精液，其特征在于，所述花青素的浓度为10-5M-10-1M，所述吡咯喹啉醌的浓度为50μM-5mM；优选的，所述花青素的浓度为10-3M，所述吡咯喹啉醌的浓度为500μM。5.一种洗精液，其特征在于，所述洗精精液溶液中还含有花青素和吡咯喹啉醌。6.如权利要求5所述的洗精液，其特征在于，所述花青素的浓度为10-5M-10-1M，所述吡咯喹啉醌的浓度为5...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵学明，朱化彬，郝海生，杜卫华，庞云渭，刘岩，赵亚涵，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11