成花素基因GmFT2a的应用制造技术

本发明专利技术公开了成花素基因GmFT2a在提高豆科植物生物固氮效率方面的新应用。所述成花素基因GmFT2a主要在根瘤发育后期表达，并定位于根瘤皮层细胞的细胞核和细胞质中，从而显著增加大豆根瘤数量、重量和固氮酶活性，提高植株氮、磷含量，并最终增加转基因植物的生物量。本发明专利技术可实现豆科作物氮、磷养分的高效利用，并为高产分子育种以及光周期广适性的遗传改良提供基因资源，且对发展减肥增效可持续生态农业具有重要的指导和实践意义。

【技术实现步骤摘要】
成花素基因GmFT2a的应用
本专利技术属于生物
，涉及基因的新应用，具体涉及成花素基因GmFT2a在促进豆科植物生物固氮，提高氮、磷效率方面的新应用。
技术介绍
大豆是典型的生物固氮作物。然而，固氮器官——根瘤的形成是发挥生物固氮作用的基础。由此，研究大豆结瘤固氮的生理与分子调控机制、挖掘大豆生物固氮潜力，对大豆固氮高效的遗传改良和以及分子育种等方面均具有重要意义。开花是植物从营养生长过渡到生殖生长的典型标志，亦是大豆产量形成的基本要素。其中，FloweringLocusT(FT)是植物开花途径中最重要的整合因子，对成花转变起着至关重要的作用。研究表明，FT基因主要在叶片中被诱导表达，合成的蛋白质由叶片经过维管束移动到茎顶端组织与FloweringLocusD(FD)和14-3-3蛋白相互作用形成复合体，共同促进下游开花基因的表达，从而促进开花。虽然，调控植物开花是FT基因的主要功能，但由于不同植物适应各自的生态环境，不同植物的FT及其同源基因也进化出不同的生物学功能。短日照条件下，通过促进马铃薯的一个FT同源基因Hd3a的表达，可继而促进块茎的形成；番茄的Single-FlowerTruss(SFT)不仅调控开花，同时对坐果也有显著的促进作用。大豆固氮器官——根瘤是在宿主根系上与微生物互作的特化器官。结瘤过程受到地上部-根系的系统信号调控。在叶片合成的FT是否通过维管组织运输到根系/根瘤，调控大豆结瘤过程，进而影响植物的养分效率。同时，大豆是严格的短日照作物，即在短日条件下比在长日条件下开花明显提前，说明成花素FT基因在长、短日照条件下存在不同的调控模式。那么，在不同光周期下，FT与大豆结瘤又存在怎样的调控关系。目前，对于FT的功能研究主要集中在地上部的开花过程，关于FT与地下部根系及豆科特有的根瘤之间的调控关系的研究还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种成花素基因GmFT2a在促进豆科植物生物固氮，提高氮、磷效率方面的应用。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术要求保护成花素基因GmFT2a在促进豆科植物生物固氮，提高氮、磷效率方面的应用。所述成花素基因GmFT2a主要在根瘤发育后期表达，其蛋白主要定位于根瘤皮层细胞的细胞核和细胞质中。所述成花素基因GmFT2a具体的应用方法是将含成花素基因GmFT2a的过表达载体转入豆科植物中，获得过量表达GmFT2a的整株转基因豆科植物。GmFT2a可以从叶片移动到根瘤，且过量表达的GmFT2a在长、短日照条件下均能显著增加豆科植物根瘤数量、重量和固氮酶活性，提高植株氮、磷含量，并最终增加转基因植物的生物量；而降低GmFT2a表达的近等基因系则显著抑制了豆科植物结瘤、氮、磷营养及生物量。专利技术人的研究将为包括大豆在内的豆科作物氮、磷养分高效和光周期广适性的高产分子育种提供基因资源。本专利技术的有益之处在于：本专利技术对增加包括大豆在内的豆科作物根瘤数目、重量、固氮酶活性，提高植株氮、磷养分效率，增加转基因植株的生物量具有重要意义，对发展减肥增效可持续生态农业具有重要的指导和实践意义，并可为高产高效及光周期广适性的大豆遗传改良提供基因资源。此外，本
技术实现思路
丰富了成花素基因的生物学功能及其在生物固氮调控机理方面的理论知识。附图说明图1为GmFT2a的表达模式分析；图2为GmFT2a启动子驱动GUS表达的组织定位分析；图3为GmFT2a在根瘤中的蛋白定位分析；图4为嫁接试验分析GmFT2a的移动性；图5为过量表达GmFT2a转基因大豆的鉴定分析；图6为不同光周期下过量表达GmFT2a对转基因大豆结瘤的影响；图7为不同光周期下过量表达GmFT2a对转基因大豆生物量及氮、磷含量的影响；图8为GmFT2a近等基因系材料的结瘤比较分析；图9为GmFT2a近等基因系材料的生物量及氮、磷含量比较分析。具体实施方式为了使本专利技术所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本专利技术所述的技术方案做进一步的说明，但是本专利技术不仅限于此。一、成花素基因GmFT2a的表达模式及组织定位分析1.成花素基因GmFT2a的表达模式分析GmFT2a基因的开放阅读框长度为531bp，编码176个氨基酸的蛋白，属于PEBP家族中的一个亚家族。为了明确GmFT2a是否在根瘤中及在不同生长期的不同组织中表达，首先分析了其表达模式。大豆种子Willimas82用3%(v/v)H2O2表面消毒一分钟，在1/2全营养液润湿的石英砂中催芽萌发7d，接种根瘤菌1h后转移到低氮营养液[(LN：530μMNH4NO3+KNO3+Ca(NO3)2·4H2O)]中处理。植物生长在长日照（LD：14h白天/10h黑夜）可控温室下进行。分别收获接种处理第5d、7d、14d、21d、30d和40d的根、根瘤、茎、叶、花等组织，并抽提RNA，反转录成cDNA，进一步用定量PCR检测GmFT2a的表达模式。以大豆的看家基因EF-1a作为内参。用于定量PCR检测基因表达量的引物分别为：大豆EF-1a基因的引物为：EF-1aF:5’-TGCAAAGGAGGCTGCTAACT-3’(SEQIDNO:1)EF-1aR:5’-CAGCATCACCGTTCTTCAAA-3’(SEQIDNO:2)GmFT2a基因的引物为：GmFT2a-qF:5’-ATCCCGATGCACCTAGCCCA-3’(SEQIDNO:3)GmFT2a-qR:5’-GCATACACGGTCTCCCTACCCA-3’(SEQIDNO:4)定量PCR反应程序为：将RNA反转录所得的cDNA稀释50倍作为定量PCR反应模板。试验中采用20μL反应体系，包括：10μL的StartTopGreenqPCRSuperMix(Trans)，各0.6μL的10μM正反向引物，2μL稀释的cDNA，最后Mili-Q水补至20μL。定量PCR反应条件为：95℃变性1min，然后94℃裂解15s，60℃结合15s，72℃延伸30s并进行40次循环。相对表达量是GmFT2a的表达与大豆看家基因表达的比值。计算采用2-△△CT方法。图1为GmFT2a的表达模式分析。由图1可见，GmFT2a主要在叶片中表达，随着根瘤生长发育至14d时，GmFT2a的mRNA随着根瘤生长发育而在根瘤中逐渐积累；在接种后30d时，GmFT2a在根瘤中的表达增加，暗示GmFT2a可能参与根瘤发育过程。GmFT2a基因启动子克隆、载体构建及组织定位分析按照常规方法，提取大豆叶片基因组DNA，并以其为模板，用上游特异引物和下游特异引物扩增GmFT2a启动子2326bp片段，PCR片段回收，通过BamHI和EcoRI对目的载体pTF102进行双酶切后，利用重组酶连接，转化大肠杆菌，单克隆测序无误后，抽质粒转化发根农杆菌K599备用。其中，上游特异引物为：5’-CTATGACATGATTACgaattcTTCCCCTTATTTCCTATCCTA-3’(SEQIDNO:5)下游特异引物为：5’-GACTGACCTACCCGGggatccGGGATAGTGTGCACACTAGTT-3’(SEQIDNO:6)通过农杆菌介导的利用大豆下胚轴注射转化法获得转基因毛状根。待毛根长出3-4cm后将主根剪掉，保留从愈伤组本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.成花素基因GmFT2a在促进豆科植物生物固氮，提高氮、磷效率方面的应用。

【技术特征摘要】
1.成花素基因GmFT2a在促进豆科植物生物固氮，提高氮、磷效率方面的应用。2.根据权利要求1所述的应...

【专利技术属性】
技术研发人员：李欣欣，廖红，艾文琴，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建,35