一种热稳定性提高的脂肪酶突变体制造技术

一种热稳定性提高的脂肪酶突变体，属于酶的基因工程技术领域。本发明专利技术公开了由米曲霉(Aspergillus oryaze)脂肪酶作为亲本，经分子生物学技术而获得的热稳定性提高的脂肪酶突变体。在这个突变体的氨基酸序列中，涉及到的氨基酸突变为：Leu156Cys。以该突变体在不同温度条件下保温10min后失去50％酶活力的温度(T50％

【技术实现步骤摘要】
一种热稳定性提高的脂肪酶突变体
本专利技术涉及一种热稳定性提高的脂肪酶突变体，具体地说涉及利用分子生物学技术获得热稳定性提高的脂肪酶突变体，属于酶的基因工程

技术介绍
近年来，脂肪酶(LipaseEC3.1.1.3)在工业应用方面取得了很大进展。脂肪酶具有对底物水解效率高、反应温和、环境友好等优点，已经在洗涤、造纸、制革、食品、纺织等领域得到了广泛的应用，并已经成为全球酶制剂市场上重要的品种。脂肪酶可以从动、植物中提取，也可以由多种微生物产生。由于微生物脂肪酶种类多，来源广，周期短，便于工业生产和提纯，所以在各领域中得到了极为广泛的应用中。米曲霉是一种非常安全的产酶菌，目前已经被美国FDA和WHO认定为安全菌株(GRAS)，它所分泌的脂肪酶AOL3(GenBankAB039325)具有安全无毒，作用底物广，对中、长链的甘油三脂具有很高的选择性等优势(ToidaJ,FukuzawaM,KobayashiG,ItoK,SekiguchiJ.CloningandsequencingofthetriacylglycerollipasegeneofAspergillusoryzaeanditsexpressioninEscherichiacoli.FEMSMicrobiolLett.2000,189:159-164.)，在食品、洗涤和生物柴油领域展现出了重要的应用潜力。但是很多食品、洗涤剂以及生物柴油的制备或者使用过程都需要在较高温度下进行，而AOL3属于中温脂肪酶，在50℃下的半衰期不到2min，热稳定性差。这不仅显著地提高了AOL3的应用成本，而且限制了它的应用领域，急需对其热稳定性进行改良和提高。定向进化属于非理性设计，是指通过在实验室中模拟达尔文自然进化过程，针对某一蛋白质酶的基因，通过随机突变人为制造大量突变，然后按照特定的需要和目的给予选择压力，筛选出具有期望特征的蛋白质，实现分子水平的模拟进化。近10年来，定向进化技术已经在脂肪酶性质改造领域取得了巨大的成功，主要集中于提高酶的热稳定性，提高酶的催化活力，改进底物特异性，对应立体选择性等方面(KatjaZorn,IsabelOroz-Guinea,HenrikeBrundiek,UweT.Bornscheuer.Engineeringandapplicationofenzymesforlipidmodification,anupdate.ProgLipidRes.2016,63:153-164)。大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚，培养周期短，抗污染能力强等特点，是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。在前期研究中，专利技术人已经成功将米曲霉脂肪酶AOL3在大肠杆菌中进行了高效表达。本专利技术以大肠杆菌为表达系统，利用易错PCR和定向进化技术对米曲霉脂肪酶AOL3进行大量随机突变和筛选，获得了热稳定性显著提高的脂肪酶突变体。酶分子的热稳定性提高可以用半衰期(t1/2)来表征。即在较高温度条件下，酶的活力降低到原来活力一半时所需的时间。半衰期长，则酶稳定性高。反之，热稳定性差。因此，t1/2的提高代表了酶分子热稳定性的提高。本专利技术中的t501/2表示在50℃条件下，脂肪酶及其突变体的半衰期。酶分子的热稳定性提高还可以用T50％10来表征。即在不同温度条件下对酶分子孵育10min，获得酶分子活力失去50％的温度，此温度越高表示酶分子热稳定性越强。定义：氨基酸和DNA核酸序列的命名法使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。脂肪酶突变体的标识采用“原始氨基酸位置置换氨基酸”来表示脂肪酶突变体中突变的氨基酸。如Leu156Cys，标识位置156的氨基酸由亲本脂肪酶的Leu替换成Cys，位置的编号对应于附件序列表中亲本米曲霉脂肪酶AOL3的氨基酸序列编号。
技术实现思路
本专利技术的技术方案：一种热稳定性提高的脂肪酶突变体，由米曲霉脂肪酶基因出发，运用易错PCR定向进化技术获得；所述的米曲霉脂肪酶具有SEQIDNo:1所示的氨基酸残基序列；所述脂肪酶突变体具有SEQIDNo：2所示的氨基酸残基序列，由254个氨基酸组成，有1个突变氨基酸，其一种编码基因的核酸序列为SEQIDNO：3。用于表达所述的脂肪酶突变体的表达载体为PET-28a；用于表达所述的表达载体的微生物宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)；与亲本米曲霉脂肪酶相比，所述脂肪酶突变体的热稳定性获得了提高，以不同温度条件下孵育10min后获得的酶活力失去一半时的温度T50％10及50℃的半衰期t501/2来表示热稳定性的提高，本专利技术的脂肪酶突变体的提高幅度如表1所示：表1本专利技术运用易错PCR以及定向进化技术对米曲霉脂肪酶进行突变和筛选，获得了脂肪酶突变体Leu156Cys。以t501/2及T50％10来表示，脂肪酶突变体的热稳定性得到了提高。具有较高的实际应用价值和广阔的市场前景。上述热稳定性提高的脂肪酶突变体可以应用于洗涤、食品、造纸或生物柴油等领域中。附图说明图1为脂肪酶突变体Leu156Cys的正向测序峰图。具体实施方式下列实施例中所用的方法，如无特殊说明均为常规方法，具体步骤可以参见：《MolecularCloning：ALaboratoryManual》(Sambrook,J.,Russell,DsvidW.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rdedition,2001,NY,ColdSpringHarbor)。所用引物均由上海生工合成。实施例中涉及到的培养基及试剂配方如下：LB液体培养基：10g/L蛋白胨，10g/LNaCl，5g/L酵母提取物，pH7.0，灭菌后4℃保存；LB固体培养基：10g/L蛋白胨，10g/LNaCl，5g/L酵母提取物，20g/L琼脂，pH7.0，灭菌后铺平板；卡那霉素(Kanamycin)：100mg/mL，水溶，过滤除菌，-20℃避光保存；实施例1利用易错PCR技术构建表达脂肪酶突变体的文库野生型米曲霉脂肪酶基因(GenBankAccession:AB039325)由上海生工合成，根据米曲霉脂肪酶基因的序列设计正向引物P1，其核苷酸序列如SEQIDNO：4所示，其中含有限制性酶EcoRI切点；反向引物P2，其核苷酸序列如SEQIDNO：5所示，其中含有限制性酶NotI切点；以合成的米曲霉基因为模板，利用易错PCR技术在体外向米曲霉脂肪酶基因引入核苷酸突变。易错PCR的反应条件如下：表2：表2反应体系PCR反应条件为：95℃5min；95℃30s，56℃30s，72℃90s，35个循环；72℃10min；然后将目标片段回收。利用限制性内切酶EcoRI和NotI进行双酶切后与经过同样双酶切的质粒pET-28a(Novagen)进行连接，转化至E.coliDH5α感受态细胞，涂布于LB固体培养基(含100μg/mL的卡那霉素)。37℃恒温培养12小时，将所有转化子转移至LB液体培养基(含100μg/mL的卡那霉素)进行培养，然后利用质粒抽提试剂盒，提取质粒。将抽提后的质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，涂布于LB固体培养基(含100μg/mL的卡那本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种热稳定性提高的脂肪酶突变体，所述的脂肪酶突变体由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的脂肪酶的156位氨基酸Leu变为Cys得到；其氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

【技术特征摘要】
1.一种热稳定性提高的脂肪酶突变体，所述的脂肪酶突变体由氨基酸序列为SEQIDNO：1的脂肪酶的156位氨基酸Leu变为Cys得到；其氨基酸序列为SEQIDNO：2。2.一种多核苷酸分子，其编码权利要求1中所述的脂肪酶突变体。3.一种重组质粒，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张田，
申请(专利权)人：张田，
类型：发明
国别省市：广东,44