一种胎盘来源的单个核细胞诱导CIK细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种胎盘来源的单个核细胞诱导CIK细胞的方法，通过采用胎盘来源的单个核细胞诱导培养CIK细胞，与采用脐带血单个细胞诱导培养相比，获得的CIK细胞CD3

【技术实现步骤摘要】
一种胎盘来源的单个核细胞诱导CIK细胞的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种胎盘来源的单个核细胞诱导CIK细胞的方法。
技术介绍
随着免疫细胞生物学及免疫学、分子生物学和基因工程技术的飞速发展，细胞介导的过继免疫治疗已成为肿瘤患者放、化疗后辅助治疗的重要手段之一。CIK细胞，即细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-InducedKiller)，是将人外周血单个核细胞(PBMC)在体外用多种细胞因子(抗CD3McAb、IL-2、IFN-γ、IL-1α等)共同诱导而获得的一群异质细胞，被称为NK样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤特点。CIK细胞主要通过三种作用途径来杀伤肿瘤细胞：一是通过不同的机制识别肿瘤细胞，释放颗粒酶/穿孔素等毒性颗粒，导致肿瘤细胞的裂解，直接杀伤肿瘤细胞；二是体外培养的CIK细胞可以分泌多种细胞因子，如IFN-γ、TNF-α、IL-2等，通过调节机体免疫系统反应性间接杀伤肿瘤细胞；三是CIK细胞在培养过程中表达FasL(Ⅱ型跨膜糖蛋白)通过与肿瘤细胞膜表达的Fas(Ⅰ型跨膜糖蛋白)结合，诱导肿瘤细胞凋亡。CIK细胞对肿瘤细胞的识别能力很强，如同“细胞导弹”，能精确“点射”肿瘤细胞，但不会伤及“无辜”的正常细胞。对手术后或放化疗后患者疗效显著，能消除残留微小的转移病灶，防止癌细胞扩散和复发，提高机体免疫力。CD3+、CD56+细胞是CIK细胞群体中主要的效应细胞，但在外周血中含量极少，仅占1％—5％。为了使CD3+、CD56+细胞含量达到临床使用所需的浓度，需要对CIK细胞进行人工培养，以获得大量CIK细胞。目前，常常采用病人外周血单个核细胞(PBMC)进行诱导培养CIK细胞。但由肿瘤患者自身外周血单个核细胞(PBMC)，诱导的CIK细胞扩增效率低，高峰延迟，杀伤活性弱，主要效应细胞CD3+、CD56+阳性比例低，CIK细胞的扩增效率及成熟率都较低，很难满足肿瘤治疗的临床需求；后来有研究者采用脐带血单个核细胞(PBMC)进行诱导培养CIK细胞，虽然不受患者本身身体条件限制，但是脐带血单个核细胞的起始数量往往偏低，无法获得足够的CIK细胞。为了解决这一问题我们需要寻求更合适的CIK细胞诱导细胞来源。而胎盘中富含游离的单个核细胞，其免疫原性弱，是诱导CIK细胞的理想材料。与来源于肿瘤患者的外周血单个核细胞相比，该途径不仅能够提高CIK细胞的扩增效率及成熟率，而且能够提高CD3+和CD56+CIK细胞数量；与来源于脐带血单个核细胞相比，该途径更能提高CD3+和CD56+CIK细胞数量，可以很好的运用于临床。
技术实现思路
本专利技术是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种胎盘来源的单个核细胞诱导CIK细胞的方法。本专利技术提供了一种胎盘来源的单个核细胞诱导CIK细胞的方法，包括以下步骤：步骤1，脐带血血浆分成两份，分别进行处理保存，其中，第一份脐带血血浆灭活后-20℃冷冻保存，第二份脐带血血浆未经灭活，在4℃下保存备用；步骤2，细胞培养瓶中加入未经灭活的脐带血血浆，在4℃下包被过夜，或者在37℃下，包被3h；步骤3，包被结束，弃去细胞培养瓶中脐带血血浆，对细胞培养瓶顺次用10mlPBS和10mlGT-T551培养液各洗涤一次；步骤4，获取胎盘来源的单个核细胞，并用GT-T551培养基制备细胞浓度为1～2×106/ml的胎盘来源的单个核细胞悬液；步骤5，向步骤3中的细胞培养瓶中加入步骤4中的细胞悬液，同时再加入步骤1中灭活脐带血血浆、IFN-γ，使灭活脐带血血浆浓度为10％，IFN-γ浓度为1000IU/ml，在37℃下、5％CO2培养箱中，培养24h；步骤6，加入与步骤5中细胞悬液体积相同的GT-T551培养基，细胞培养瓶中加入IL-1、CD3单抗、IL-2、脐带血血浆，使其终浓度为IL-1100IU/ml、CD3单抗50ng/ml、IL-2300IU/ml、脐带血血浆10％，在37℃下、5％CO2培养箱中培养；步骤7，第4天，加入20mlGT-T551培养液，并添加IL-2，使IL-2终浓度为300IU/ml，在37℃下、5％CO2培养箱中培养；步骤8，每隔2天或3天补加1次GT-T551培养液，每次添加的GT-T551培养液体积与培养瓶中液体体积相同，并补充IL-2浓度至300IU/ml，在37℃下、5％CO2培养箱中培养；步骤9，第15天，收集培养瓶中的全部培养基及细胞，以500g/min离心10min，收集沉淀，沉淀即为CIK细胞。在本专利技术还具有这样的特征：脐带血血浆的制备方法如下：步骤1-1，用含抗凝剂的无菌采血袋，穿刺脐带静脉，采集脐带血；步骤1-2，将脐带血在3000rpm下，离心15min，弃去沉淀，获取上清液，即为脐带血血浆。进一步地，抗凝剂为肝素钠或CPDA-1。在本专利技术还具有这样的特征：步骤4中，胎盘来源的单个核细胞的获得方法如下：步骤4-1，将胎盘组织用含1％青霉素-链霉素双抗的PBS冲洗，重复多次，以除尽胎盘组织表面的血块和其他杂质；步骤4-2，从胎盘母体面剪下胎盘小叶，将胎盘小叶剪碎成多个体积为1～5mm3的组织块，把该组织块放入200目滤网，用含1％青霉素-链霉素双抗的PBS冲洗过滤，直至红色变浅，收集过滤液；步骤4-3，将步骤4-2中的过滤液经1800rpm离心10min，弃上清，下层细胞用含1％青霉素-链霉素双抗的PBS重悬，重悬液缓慢加入人外周血淋巴细胞分离液，重悬液与人外周血淋巴细胞分离液体积比为4:3，离心，该离心条件为800g，15min，加速为1，降速为0；步骤4-4，离心结束，离心管中液体分为4层，吸取中间白膜层细胞，用GT-551培养基重悬细胞，对重悬液离心，该离心条件为600g，10min；步骤4-5，离心结束弃上清，收集沉淀，用GT-551培养基重悬细胞，对重悬液离心，该离心条件为500g离心10min；步骤4-6，离心结束弃上清，收集沉淀，用CIK完全培养基重悬细胞，计数待用。进一步地，步骤4-6中CIK完全培养基重悬细胞含有1000IU/mlIL-2、以及GT-551培养基。本专利技术的优点如下：胎盘来源的单个核细胞免疫原性弱，采用该来源的单个核细胞作为诱导CIK细胞的材料，不仅能够提高CD3+和CD56+CIK细胞数量，而且能够提高CIK细胞的存活率及CD3+CD56+双阳性率，很好的满足肿瘤治疗的临床需求。附图说明图1是本专利技术的实施例中胎盘来源的单个核细胞诱导CIK第2天细胞形态图；图2是本专利技术的实施例中胎盘来源的单个核细胞诱导CIK第4天细胞形态图；图3是本专利技术的实施例中胎盘来源的单个核细胞诱导CIK第6天细胞形态图；图4是本专利技术的实施例中胎盘来源的单个核细胞诱导CIK第8天细胞形态图；图5是本专利技术的实施例中胎盘来源的单个核细胞诱导CIK第10天细胞形态图；图6是本专利技术的实施例中胎盘来源的单个核细胞诱导CIK第15天细胞形态图；图7-a是本专利技术的实施例中胎盘来源的单个核细胞诱导CIK第10天细胞流式表型图，CD3+CD56+双阳性比例为23.63％；图7-b是本专利技术的实施例中脐带血单个核细胞诱导CIK第10天细胞流式表型图，CD3+CD56+双阳性比例为23.00％；图8-a是本本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种胎盘来源的单个核细胞诱导CIK细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，脐带血血浆分成两份，分别进行处理保存，其中，第一份脐带血血浆灭活后‑20℃冷冻保存，第二份脐带血血浆未经灭活，在4℃下保存备用；步骤2，细胞培养瓶中加入未经灭活的脐带血血浆，在4℃下包被过夜，或者在37℃下，包被3h；步骤3，包被结束，弃去细胞培养瓶中的脐带血血浆，对细胞培养瓶顺次用10ml PBS和10ml GT‑T551培养液各洗涤一次；步骤4，获取胎盘来源的单个核细胞，并用GT‑T551培养基制备细胞浓度为1～2×106/ml的胎盘来源的单个核细胞悬液；步骤5，向步骤3中的细胞培养瓶中加入步骤4中的细胞悬液，同时再加入步骤1中灭活脐带血血浆、IFN‑γ，使灭活脐带血血浆浓度为10％，IFN‑γ浓度为1000IU/ml，在37℃下、5％CO2培养箱中，培养24h；步骤6，加入与步骤5中细胞悬液体积相同的GT‑T551培养基，细胞培养瓶中加入IL‑1、CD3单抗、IL‑2、脐带血血浆，使其终浓度为IL‑1 100IU/ml、CD3单抗50ng/ml、IL‑2 300IU/ml、脐带血血浆10％，在37℃下、5％CO2培养箱中培养；步骤7，第4天，加入20ml GT‑T551培养液，并添加IL‑2，使IL‑2终浓度为300IU/ml，在37℃下、5％CO2培养箱中培养；步骤8，每隔2天或3天补加1次GT‑T551培养液，每次添加的GT‑T551培养液体积与培养瓶中液体体积相同，并补充IL‑2浓度至300IU/ml，在37℃下、5％CO2培养箱中培养；步骤9，第15天，收集培养瓶中的全部培养基及细胞，以500g/min离心10min，收集沉淀，沉淀即为CIK细胞。...

【技术特征摘要】
1.一种胎盘来源的单个核细胞诱导CIK细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，脐带血血浆分成两份，分别进行处理保存，其中，第一份脐带血血浆灭活后-20℃冷冻保存，第二份脐带血血浆未经灭活，在4℃下保存备用；步骤2，细胞培养瓶中加入未经灭活的脐带血血浆，在4℃下包被过夜，或者在37℃下，包被3h；步骤3，包被结束，弃去细胞培养瓶中的脐带血血浆，对细胞培养瓶顺次用10mlPBS和10mlGT-T551培养液各洗涤一次；步骤4，获取胎盘来源的单个核细胞，并用GT-T551培养基制备细胞浓度为1～2×106/ml的胎盘来源的单个核细胞悬液；步骤5，向步骤3中的细胞培养瓶中加入步骤4中的细胞悬液，同时再加入步骤1中灭活脐带血血浆、IFN-γ，使灭活脐带血血浆浓度为10％，IFN-γ浓度为1000IU/ml，在37℃下、5％CO2培养箱中，培养24h；步骤6，加入与步骤5中细胞悬液体积相同的GT-T551培养基，细胞培养瓶中加入IL-1、CD3单抗、IL-2、脐带血血浆，使其终浓度为IL-1100IU/ml、CD3单抗50ng/ml、IL-2300IU/ml、脐带血血浆10％，在37℃下、5％CO2培养箱中培养；步骤7，第4天，加入20mlGT-T551培养液，并添加IL-2，使IL-2终浓度为300IU/ml，在37℃下、5％CO2培养箱中培养；步骤8，每隔2天或3天补加1次GT-T551培养液，每次添加的GT-T551培养液体积与培养瓶中液体体积相同，并补充IL-2浓度至300IU/ml，在37℃下、5％CO2培养箱中培养；步骤9，第15天，收集培养瓶中的全部培养基及细胞，以500g/min离心10min，收集沉淀，沉淀即为CIK细胞。2.根据权利要求1所述的胎盘来源的单个核细胞诱导CIK细...

【专利技术属性】
技术研发人员：张瑞婷，朱丰城，王浩，
申请(专利权)人：希瑞干细胞科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32