一种人CYR61蛋白Ser167位点磷酸化抗原、抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开一种人CYR61蛋白Ser167位点磷酸化抗原、抗体及其制备方法和应用，涉及抗体及其制备技术领域。所述抗体是通过SEQ ID NO：1所示的活性氨基酸序列为抗原肽免疫动物制备得到的。本发明专利技术提供的磷酸化抗体有助于研究介导其发生磷酸化作用的激酶，探讨CYR61蛋白的多种生物学功能；实际应用中便于研究人CYR61蛋白特定位点磷酸化修饰在特定生物学事件或疾病发生发展过程中的作用机制，亦可用于检测用药后肿瘤相关蛋白表达的差异，为临床肿瘤疾病的诊断与治疗提供潜在的作用靶点。

【技术实现步骤摘要】
一种人CYR61蛋白Ser167位点磷酸化抗原、抗体及其制备方法和应用
本专利技术涉及抗体及其制备
，特别涉及一种特异性针对人CYR61蛋白Ser167位点磷酸化抗原、抗体及其制备方法和应用。
技术介绍
CCN家族由6个拥有相似功能区的蛋白组成，CYR61是该家族中第一个被发现的蛋白。该家族蛋白一直以来被认为是分泌蛋白，并作为细胞基质蛋白被深入研究。CCN家族蛋白在细胞内合成，并在信号肽的引导下分泌到细胞外，它们在肿瘤发生和发展中伴随着肿瘤内外环境的一系列改变，可在细胞内和细胞外起作用。该家族蛋白参与了细胞粘附、分裂、迁移、耐药、存活、分化、血管生成、纤维化、骨骼生成和创伤愈合等生理过程，其中的很多现象与肿瘤相关。CYR61(CCN1)、CTGF(CCN2)、CCN5基因敲除小鼠往往死于胚胎期或出生早期。CYR61在肿瘤中所表现的生物学功能是多样的，并且在不同的肿瘤组织细胞中，CYR61的功能也不尽相同。CYR61mRNA高表达于恶性乳腺肿瘤细胞，还能促进胃腺癌细胞RF-1细胞恶化；同时CYR61在卵巢癌中高表达，并且和淋巴结转移正相关。然而CYR61在肺癌、平滑肌瘤中的表达水平却明显降低，作为肿瘤抑制因子发挥着重要作用。例如，在非小细胞肺癌中CYR61的表达低于癌旁正常肺组织，并与肺癌病理类型、淋巴结转移等因素相关。目前研究表明：CYR61蛋白主要与肿瘤细胞的增殖和迁移、肿瘤细胞的生长调节和肿瘤血管形成有关，其作用机制可通过相关的信号通路来完成。在组织中CYR61的过表达也可以促进其受体AVβ3的表达，形成“CYR61-ACβ3自分泌调节环路”，产生细胞生长和抗凋亡信号。在乳腺癌中，HRG通过CYR61上调AVβ3的水平，CYR61与AVβ3结合激活ERK1/ERK2MAPK信号通路，抑制P53的聚集，产生抗紫杉醇耐药作用。在神经胶质瘤细胞中，CYR61通过整联蛋白偶联激酶(ILK)使糖原合成激酶-3β(GSK3-β)磷酸化，激活β-catenin/LEF通路，从而促进细胞增殖基因的表达，CYR61还可通过激活PI3K/AKT信号通路促使凋亡蛋白Bad活性降低，促进细胞生长和迁移。在肺癌中，CYR61作为肿瘤抑制因子发挥着重要作用。在体外实验中，CYR61导致G0/G1期的阻滞，可以抑制肺癌细胞的生长。磷酸化、泛素化等翻译后修饰在细胞信号通路介导的生理和病理过程中发挥着关键作用。鉴于CYR61在肿瘤发生和发展过程中发挥的重要作用，因而进一步研究CYR61蛋白的翻译后修饰具有重要意义。我们前期研究发现，CYR61氨基酸序列中的Ser167位点是其蛋白磷酸化修饰的位点，在调控CYR61蛋白自身稳定性中可能具有重要的作用。抗体是蛋白质功能研究的重要工具，已被广泛用于肿瘤等疾病诊断、治疗等临床应用中，因而一种特异识别人CYR61的Ser167磷酸化位点的抗体有待于进一步的开发。
技术实现思路
为了解决CYR61蛋白磷酸化修饰有效研究的问题，为此，本专利技术的首要目的在于提供一种特异性针对人CYR61蛋白Ser167位点磷酸化抗原肽。本专利技术的另一目的在于提供一种特异性针对人CYR61蛋白Ser167位点磷酸化抗体。本专利技术的另一目的在于提供上述抗原肽和抗体的应用。本专利技术的再一目的在于提供上述抗体的制备方法。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种特异性针对人CYR61蛋白Ser167位点磷酸化抗原肽，其活性氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，且其中的Ser氨基酸被磷酸化修饰。一种特异性针对人CYR61蛋白Ser167位点磷酸化抗体，其是通过上述特异性针对人CYR61蛋白Ser167位点磷酸化抗原肽免疫动物制备得到的。所述的特异性针对人CYR61蛋白Ser167位点磷酸化抗体的制备方法，包括如下步骤：(1)合成SEQIDNO：1所示的活性氨基酸序列的抗原肽，氨基酸Ser上添加有磷酸化基团；(2)利用步骤(1)合成的抗原肽的N末端与载体蛋白血蓝蛋白(KLH)进行偶联，免疫动物并收集抗血清；(3)将步骤(2)收集的抗血清进行纯化和鉴定，得到特异性针对人CYR61蛋白Ser167位点磷酸化抗体。上述步骤(1)中所述的抗原肽可以通过以下步骤合成：制备人CYR61蛋白Ser167位点磷酸化抗原肽，以CYR61蛋白Ser167位点为中心，N端毗邻四个CYR61氨基酸序列，C端连接五个氨基酸序列，如SEQIDNO：1所示的合成肽，并采用多肽合成技术进行合成，在氨基酸Ser167上添加磷酸化基团。上述步骤(2)中所述的免疫动物的步骤可以包括：用上述步骤(1)合成的抗原肽偶联血蓝蛋白与佐剂联合免疫新西兰大白兔；免疫方式为经颈部、背部皮肤较薄、松弛的部位两侧皮下注射，臀肌与大腿部两侧分别肌肉注射，腰部两侧皮内注射，爪垫注射等多部位多点注射；免疫次数包括1次引发注射，3～4次加强注射和最后一次抗原直接注射。上述步骤(3)中所述的纯化和鉴定的步骤可以包括：将上述步骤(2)收集的抗血清以ELISA实验测定抗血清针对目的合成肽(抗原肽)的效价及其是否能够特异性识别目的合成肽(抗原肽)，利用亲和分离-亲和纯化循环技术对抗血清进行纯化，以WesternBlot实验确定抗血清是否能够特异性识别Ser167位点磷酸化的CYR61蛋白。上述利用亲和分离-亲和纯化循环技术对抗血清进行纯化的步骤可以包括：采用合成肽偶联载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)与琼脂糖层析柱的亲和层析法进行抗体亲和分离及亲和纯化；首先采用非磷酸化合成肽偶联牛血清白蛋白(BSA)与琼脂糖作为层析柱的填料进行亲和分离除去抗血清中的非磷酸化抗体，得到含磷酸化抗体流出液；接着使用磷酸化合成肽(抗原肽)偶联牛血清白蛋白(BSA)与琼脂糖作为层析柱的填料进行亲和纯化，除去磷酸化抗体中低亲和力的低序列复杂性表位抗体。上述特异性针对人CYR61蛋白Ser167位点磷酸化抗原肽和/或抗体在制备用于肿瘤、血液系统、心血管系统疾病的诊断、治疗及预后判定的药物制剂中的应用。本专利技术还提供一种用于肿瘤、血液系统、心血管系统疾病的诊断、治疗及预后判定的药物制剂，其包括上述特异性针对人CYR61蛋白Ser167位点磷酸化抗原肽和/或抗体。本专利技术制备得到的高特异性的针对人CYR61蛋白Ser167位点磷酸化抗体可用Westernblot实验可检测正常细胞、肿瘤细胞及用药后肿瘤细胞的表达差异，有助于研究CYR61蛋白的磷酸化修饰在肿瘤疾病发生发展过程中的作用，为临床肿瘤疾病的诊断或治疗提供潜在的作用靶点，还可以用IHC、ELISA等免疫学相关实验以检测人CYR61蛋白的磷酸化水平，探讨其与肿瘤、血液系统、心血管系统等疾病的关系，在疾病诊断、治疗及预后判定等方面具有广泛的临床应用前景。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：(1)本专利技术提供的磷酸化抗体在实际应用中能够检测人CYR61蛋白的翻译后磷酸化修饰情况；(2)本专利技术提供的磷酸化抗体实际应用中便于研究人CYR61蛋白特定位点磷酸化修饰在特定生物学事件如肿瘤细胞化疗耐药、DNA损失、细胞周期等的相关性；(3)本专利技术是针对人CYR61蛋白Ser167位点磷酸化多克隆抗体，有助于研究介导其发生磷酸化作用的激酶，探讨CYR61蛋白的多种生物学功能；(4)本专利技术提供的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种特异性针对人CYR61蛋白Ser167位点磷酸化抗原肽，其特征在于：其活性氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，且其中的Ser氨基酸被磷酸化修饰。

【技术特征摘要】
1.一种特异性针对人CYR61蛋白Ser167位点磷酸化抗原肽，其特征在于：其活性氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，且其中的Ser氨基酸被磷酸化修饰。2.一种特异性针对人CYR61蛋白Ser167位点磷酸化抗体，其特征在于：其是通过权利要求1所述的特异性针对人CYR61蛋白Ser167位点磷酸化抗原肽免疫动物制备得到的。3.一种特异性针对人CYR61蛋白Ser167位点磷酸化抗体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)合成SEQIDNO：1所示的活性氨基酸序列的抗原肽，氨基酸Ser上添加有磷酸化基团；(2)利用步骤(1)合成的抗原肽的N末端与载体蛋白血蓝蛋白进行偶联，免疫动物并收集抗血清；(3)将步骤(2)收集的抗血清进行纯化和鉴定，得到特异性针对人CYR61蛋白Ser167位点磷酸化抗体。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的抗原肽通过以下步骤合成：制备人CYR61蛋白Ser167位点磷酸化抗原肽，以CYR61蛋白Ser167位点为中心，N端毗邻四个CYR61氨基酸序列，C端连接五个氨基酸序列，如SEQIDNO：1所示的合成肽，并采用多肽合成技术进行合成，在氨基酸Ser167上添加磷酸化基团。5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的免疫动物的步骤包括：用上述步骤(1)合成的抗原肽偶联血蓝蛋白与佐剂联合免疫新西兰大白兔；免疫方式为经颈部、背部皮肤较薄、松弛的部位两...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹东，胡开顺，李瑜，林乐航，吴雯静，
申请(专利权)人：中山大学孙逸仙纪念医院，
类型：发明
国别省市：广东,44