α-烯烃的生产制造技术

本发明专利技术涉及α‑烯烃的生物合成。特别是本发明专利技术提供了使用对8至14个碳的游离脂肪酸(特别是对C8‑C12游离脂肪酸，更特别是对C12游离脂肪酸)具有脱羧酶活性的多肽，或者使用表达或过表达所述多肽的基因工程宿主细胞生产中链α‑烯烃(更特别是C11α‑烯烃)的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】α-烯烃的生产
本申请总体上涉及生物合成方法。具体而言，本申请涉及α-烯烃(olefin)的生物合成。
技术介绍
不饱和烃如α-烯烃是工业上重要的一组分子，其除了用作燃料外，还可用作用于润滑油和表面活性剂的前体，或作为原料用于进一步化学转化为例如燃料、聚合物、塑料、纺织品、溶剂、粘合剂等。α-烯烃，更具体地说是直链α-烯烃，传统上是通过乙烯的低聚从石油来源生产的，但是寻找生产此类α-烯烃的替代方法，特别是从可再生资源生产生产此类α-烯烃的替代方法将是有利的。此外，化学合成产生显示不同碳链长度的直链α-烯烃的混合物。作为用于进一步化学转化例如生产感兴趣的聚α-烯烃的原料，此类混合物可能不是合意的。已经报道了烯烃的微生物生产。例子包括在藤黄微球菌(Micrococcusluteus)中负责通过两个脂肪酰基-辅酶A(酰基-CoA)分子的头对头缩合产生具有内部双键的烯(链烯烃，alkene)的三基因簇(Belleretal.2010ApplEnvironMicrobiol76:1212-1223)；来自Jeotgalicoccussp.ATCC8456的独特的P450脱羧酶OleTJE，其在H2O2存在下直接将C12至C20游离脂肪酸脱羧以形成α-烯烃(WO2009/085278,Rudeetal.2011ApplEnvironMicrobiol77:1718-1727,Liuetal.2014BiotechnologyforBiofuels7:28)；另一种cyp152P450酶家族的酶，即来自枯草芽孢杆菌枯草亚种菌株168的P450BSβ的酶，已经显示了其对棕榈酸的脱羧酶活性(WO2009/085278,Rudeetal.2011)；以及来自聚球蓝细菌(Synechococcussp.)PCC7002的I型聚酮合酶(polyketidesynthase)，其能够经由顺序的聚酮合酶链延伸、酮还原、由其磺基转移酶结构域介导的磺化作用、以及通过硫酯酶结构域催化的偶联水解和脱羧来将脂肪酰基-ACP转化为α-烯烃(Mendez-Perezetal.2011ApplEnvironMicrobiol77:4264-4267)。总的来说，需要α-烯烃的替代生产方法，并且更特别是允许以更低的成本生产α-烯烃和/或更环境友好的改善方法。也期望提供允许定制α-烯烃的碳链长度的生产方法，更特别是用于中链α-烯烃(即，具有7-13的碳链长度的α-烯烃)，更特别是C11α-烯烃的生产方法。
技术实现思路
本专利技术解决了现有技术中的一个或多个上述问题。具体而言，提供了用于生产α-烯烃的方法，该方法允许控制α-烯烃的碳链长度。本专利技术至少部分基于这样的发现：酸热脂环酸杆菌(Alicyclobacillusacidocaldarius)和Staphylococcusmassiliensis的某些基因组序列编码具有游离脂肪酸脱羧酶活性的酶。这些生物体没有一个之前被报道过生产末端烯烃。进一步地已经发现可以鉴定某些多肽，所述多肽对中链游离脂肪酸(特别是C8至C12游离脂肪酸，更特别是C12游离脂肪酸)具有特异性脱羧酶活性，从而生产中链α-烯烃，特别是C7至C11α-烯烃，更特别是C11α-烯烃。本申请提供了其实例，更特别是在Staphilococcusmassiliensis中鉴定的烯烃生产酶(Sm46)、来自枯草芽孢杆菌枯草亚种菌株168的P450BSβ脂肪酸羟化酶、以及在酸热脂环酸杆菌中鉴定的脱羧酶对C12游离脂肪酸具有特异性脱羧酶活性，从而生产C11α-烯烃。这些酶的鉴定有助于进一步鉴定来自其他生物体的相似酶。本专利技术特别是通过以下编号的方面和实施方案(i)至(xvii)的任一个或一个或多个的任意组合来获取，其中：(i)生产C7-C11α-烯烃的方法，其包括将包含编码脱羧酶的重组核酸的重组宿主细胞在适于由所述重组宿主细胞生产C7-C11α-烯烃的条件下培养，其中所述脱羧酶的优选底物是C8-C12游离脂肪酸。(ii)根据(i)的方法，其中编码脱羧酶的所述核酸包含与SEQIDNO:10、SEQIDNO:7、SEQIDNO:3或SEQIDNO:5具有至少约75％、优选至少约80％、更优选至少约95％序列同一性的核苷酸序列，并且其中所述重组核酸确保所述脱羧酶的表达或过表达。(iii)根据(i)或(ii)的方法，其中所述核酸编码包含与SEQIDNO:13、SEQIDNO:8、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6具有至少80％、优选至少90％同一性的氨基酸序列的多肽或所述多肽的活性片段。(iv)根据(i)至(iii)中任一项的方法，其中所述核酸编码包含SEQIDNO:13的氨基酸序列的多肽。(v)根据(i)至(iv)中任一项的方法，其中C12游离脂肪酸是所述脱羧酶的优选底物，并且其中所述α-烯烃是C11α-烯烃。(vi)根据(i)至(v)中任一项的方法，其中在包含C8-C12游离脂肪酸，优选C12游离脂肪酸的培养基中培养所述宿主细胞。(vii)根据(i)至(vi)中任一项的方法，其中所述宿主细胞进一步被基因工程化以生产或过量生产C8-C12游离脂肪酸，优选C12游离脂肪酸。(viii)根据(vii)的方法，其中所述宿主细胞包含编码酶的重组核酸，所述酶参与具有包含8至12之间碳链长度的游离脂肪酸，更特别是C12游离脂肪酸的生产。(ix)根据(viii)的方法，其中所述宿主细胞包含编码对C8至C12酰基-ACP，优选对C12酰基-ACP具有活性的硫酯酶的重组核酸。(x)根据(i)至(ix)中任一项的方法，其中所述宿主细胞是产油(含油，oleaginous)宿主细胞。(xi)根据(i)至(x)中任一项的方法，其中所述宿主细胞选自下组，所述组包含细菌、酵母、真菌、植物和藻类。(xii)根据(i)至(xi)中任一项的方法，其还包括从宿主细胞或培养基中回收α-烯烃的步骤。(xiii)生产聚α-烯烃的方法，其包括以下步骤：i)按照根据(i)至(xii)中任一项的方法生产C7-C11α-烯烃；和ii)使用在步骤i)中获得的α-烯烃作为单体进行低聚反应以生产低聚物；和任选地，iii)氢化步骤ii)中生产的低聚物。(xiv)根据(xiii)的方法，其中所述聚α-烯烃是C33聚α-烯烃，其中步骤i)包含生产C11α-烯烃，且其中步骤ii)中的低聚反应是三聚反应。(xv)组合物，其包含可通过根据(xiv)的方法获得的聚α-烯烃，其中所述聚α-烯烃的至少85％、优选至少90％、更优选至少95％是C33聚α-烯烃。(xvi)具有脱羧酶活性的多肽，其中所述多肽包含与SEQIDNO:13具有至少80％，优选至少90％同一性的氨基酸序列。(xvii)编码具有脱羧酶活性的酶的分离的核酸，其中所述核酸包含与SEQIDNO:7或SEQIDNO:5具有至少约80％，更优选至少约95％序列同一性的核苷酸序列。(xviii)根据(xvi)的多肽或根据(xvii)的分离的核酸，其中C8至C14游离脂肪酸，优选C8至C12游离脂肪酸，更优选C12游离脂肪酸是所述脱羧酶的优选底物。(xix)根据(xvii)或(xviii)的分离的核酸，其中所述核酸包含与SEQIDNO:7具有至少约95％序列同一本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.生产C7‑C11α‑烯烃的方法，其包括将包含编码脱羧酶的重组核酸的重组宿主细胞在适于由所述重组宿主细胞生产C7‑C11α‑烯烃的条件下培养，其中所述脱羧酶的优选底物是C8‑C12游离脂肪酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.06.30 EP 15174554.41.生产C7-C11α-烯烃的方法，其包括将包含编码脱羧酶的重组核酸的重组宿主细胞在适于由所述重组宿主细胞生产C7-C11α-烯烃的条件下培养，其中所述脱羧酶的优选底物是C8-C12游离脂肪酸。2.权利要求1的方法，其中编码脱羧酶的所述核酸包含与SEQIDNO:10、SEQIDNO:7、SEQIDNO:3或SEQIDNO:5具有至少约75％、优选至少约80％、更优选至少约95％序列同一性的核苷酸序列，并且其中所述重组核酸确保所述脱羧酶的表达或过表达。3.根据权利要求1或2的方法，其中所述核酸编包含与SEQIDNO:13、SEQIDNO:8、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6具有至少80％、优选至少90％同一性的氨基酸序列的多肽或所述多肽的活性片段。4.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中所述核酸编码包含SEQIDNO:13的氨基酸序列的多肽。5.根据权利要求1至4中任一项的方法，其中C12游离脂肪酸是所述脱羧酶的优选底物，并且其中所述α-烯烃是C11α-烯烃。6.根据权利要求1至5中任一项的方法，其中在包含C8-C12游离脂肪酸，优选C12游离脂肪酸的培养基中培养所述宿主细胞。7.根据权利要求1至6中任一项的方法，其中所述宿主细胞已经进一步地被基因工程化以生产或过量生产C8-C12游离脂肪酸，优选C12游离脂肪酸。8.根据权利要求7的方法，其中所述宿主细胞包含编码如下酶的重组核酸：所述酶参与具有包含8至12之间碳链长度的游离脂肪酸，更特别是C12游离脂肪酸的生产。9.根据权利要求8的方法，其中所述宿主细胞包含编码对C8至C12酰基-ACP，优选对C12酰基-ACP具有活性的硫酯酶的重组核酸。10.根据权利要求1至9中任一项的方法，其中所述宿主细胞是产油宿主细胞。11.根据权利要求1至10中任一项的方法，其中所述宿主细胞选自下组，所述组包含细菌、酵母、真菌、植物和藻类。12.根据权利要求1至11中任一项的方法，其还包括从所述宿...

【专利技术属性】
技术研发人员：L富拉格，F劳费尔，H施特鲁布，王允，徐健，徐卉芳，李盛英，
申请(专利权)人：道达尔销售服务公司，中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：法国,FR