一种用于单细胞分离的微流体等分芯片制造技术

在本发明专利技术中，通常用于装配在培养皿中的微流体等分芯片具有通过多个微通道连接到多个侧孔(出口)的中心孔(入口)，可以将具有多个细胞的相对大的(例如120μL)细胞悬浮液注入微流体等分芯片的入口，单个细胞可以通过正压力驱动流大致同时且均匀地分布到若干个侧孔中，侧孔可在1分钟内收集到单个细胞；微流体等分芯片具有高效的细胞回收率。由于其具有快速分离和易于鉴定单细胞的优点，同时可以保证高细胞活力，高富集效率，便于微量单细胞悬液的转移，微流体等分芯片可以用于分离血液中的CTC细胞，进行单细胞克隆，PCR和测序等用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种用于单细胞分离的微流体等分芯片
在本专利技术的一些实施例中，本专利技术广泛涉及单细胞分离的方法和装置领域，具体地，涉及一种使用微流体技术分离单细胞的技术，具体地，涉及一种用于单细胞分离的微流体等分芯片。
技术介绍
微流体是一个跨多学科领域的工程技术，涉及物理、化学、生物化学、纳米技术和生物技术等多种领域，将系统设计进行实际应用，处理少量流体以实现多路复用，自动化和高通量筛选。微流体技术的进步正在彻底改变用于酶分析(例如，葡萄糖和乳酸测定)，DNA分析(例如，聚合酶链反应和高通量测序)和蛋白质组学的分子生物学程序，微流体生物芯片的基本思想是在一个芯片上集成检测操作，如检测，以及样品预处理和样品制备。有越来越多的证据表明细胞群中的表型和基因型异质性广泛存在。来自个体稀有细胞的关键信息可能会被大量细胞的分析结果掩盖。因此，单细胞分析，尤其是DNA和RNA的测序，对于克隆突变，肿瘤进化，胚胎发育和免疫干预变得非常重要。这种下游单细胞遗传分析的初始和关键步骤是有效地将感兴趣的活细胞从异质细胞群分离到亚微量培养基体积中，然后进行PCR(聚合酶链式反应)分析。(PCR是一种分子生物学技术，用于将DNA的单复制体或多个复制体扩增几个数量级，产生数千至数百万个的特定DNA序列。)除了主要用于从福尔马林固定的石蜡包埋组织中分离单细胞的激光捕获显微切割外，目前主要有四种用于从细胞悬浮液中分离单细胞的方法。作为最常用的方法，连续稀释已广泛应用于集落形成，但不适用于PCR分析，其中单个细胞应被分离成亚微量悬浮液以进行更好的扩增反应。即便如此，仍然需要这些集落进行进一步分析，以判断它们是否来源于接种到96孔板后非常难以准确计数的单细胞。显微操作主要用于分离单个细胞为基因组/转录组进行测序，然而，耗时的过程和低吞吐量特性使其难以满足快速准备数十甚至数百个单细胞10的需求。此外，当使用研究人员的口部来吸附单细胞时，该技术似乎非常依赖于研究人员的个人技能。流式细胞术是一种成熟的方法，特别适用于基于预设荧光门控策略的特定细胞的高通量分选，但维持高单细胞活力具有挑战性，且其在细胞数量有限的情况下不起作用，如只有珍贵的临床样本可用时，该种方法不适用。由于微通道和细胞的尺寸相当，最近开发的微流体技术为单细胞操作提供了重要途径；然而，其潜在的缺点，例如需要额外的微流体操作技能，与现有实验平台的不良兼容性，以及无法/难以从微芯片中选择性地检索分离的单细胞用于进一步分析，极大地限制了它们在普通实验室中的应用。通过引用并入本文的US6632656(2003-10-14；Thomas等人)公开了用于在液体培养基中进行细胞生长和基于细胞的测定的装置和方法。该装置包括支撑多个微通道元件的基板，每个微通道元件包括细胞生长室，用于向其供应液体样品的入口通道和用于从其中移除液体样品的出口通道，位于其上方的盖板底板用于限定腔室和连接通道，盖板上设有孔以提供通道的通道。将平均值掺入细胞生长室中，用于细胞附着和细胞生长。更具体地，如其中所示和所述：参考图1。如图1b所示，该装置包括可旋转的圆盘(18)，微制造以提供朝向圆盘中心定位的样品引入端口并连接到环形的样品贮存器(9)，该样品贮存器又连接到多个径向分散的微通道分析元件(6)，每个所述微通道元件包括细胞生长室，样品入口通道和用于从中除去液体的出口通道，以及定位在所述盘上的盖板，以限定封闭的腔室和连接通道。每个微通道元件的一端连接到中央的样品贮存器(9)，并且在相对端连接到公共废物通道(10)。微制造装置的每个径向分散的微通道元件(6)(如图1a所示)包括在其左端连接到贮存器(9)的样品入口通道(1)，用于进行细胞生长的细胞生长腔室(2)，并通过通道(4)连接到化验室(3)和出口通道(5)，其在其右手端连接到废物通道(10)。盘(18)是单件或两件式模制结构，并且由透明的塑料或聚合物材料通过单独的模制件形成，这些模制件组装在一起以提供在限定位置处具有开口的封闭结构以装载带有液体和去除废液的装置。在最简单的形式中，该装置被制成两个互补的部分，每个都承载模制结构，当它们固定在一起时，在固体盘的主体内形成一系列互连的微通道元件。或者，微通道元件可以通过微加工方法形成，其中形成微通道元件的微通道和腔室被微加工到盘的表面中，以及盖板，例如塑料膜，粘附在表面上以封闭通道和腔室。装置的规模在一定程度上取决于其使用，即装置的尺寸与真核细胞的使用相容。这将对设计为允许细胞移动的任何通道施加下限，并且将根据每个测定中存在的细胞数确定细胞容纳或生长区域的大小。作为贴壁培养物生长的平均哺乳动物细胞具有～300μm2的面积；非贴壁细胞和非附着贴壁细胞的球形直径为～10μm。因此，用于装置内的细胞移动的通道可能具有约20-30μm或更大的尺寸。细胞保持区域的大小将取决于进行测定所需的细胞数量(该数量由灵敏度和统计学要求确定)。设想典型的测定将需要最少500-1000个细胞，对于贴壁细胞，其需要150,000-300,000μm2的结构，即直径为约400-600μm的圆形“孔”。优选地选择微通道的构造以允许通过样品入口端口将细胞在流体介质中的悬浮液施加到样品贮存器，同时旋转细胞生长室。盘(18)通过合适的装置以足以通过离心力的速度使细胞悬浮液向外朝向盘周边移动。液体的移动使细胞悬浮液沿着每个入口微通道(1,8)朝向细胞生长室(2,7)分布。选择盘的旋转速度提供足够的离心力以允许液体流动以填充细胞生长室(2,7)，但是不足以使液体进入直径较小的受限通道(4,16)，即细胞生长室的相对侧。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种用于简单、快速且可通用的单细胞分离的技术。等分通常是指从较大量的物质(通常是液体)中取出代表性样品。在这种情况下，等分是指从具有大量细胞的悬浮液中分离单个细胞。该过程在液体环境中使用微流体技术完成，因此被称为“微流体等分”。根据本专利技术，通常，微流体等分芯片(或基板，其可以被称为“MA芯片”或其变体)，其可以是盘的形式并可以适合于装配在培养皿中，具有通过多个微通道连接到多个侧(或外)孔(出口)的中心孔(入口)。在操作中，可以将具有少量(例如约2-120)个细胞的细胞悬浮液注入微流体等分芯片的入口(通过具有正压的移液管推入中心孔)，并且可以是单个细胞。并且可以将单个细胞通过微通道通过正压力驱动流动到一些侧(外)孔。根据本专利技术的一些实施例，用于进行单细胞分离的微流体等分芯片可包括：盘形式的芯片，其具有半径，中心，顶表面，底表面，外缘和厚度，单个中心孔(入口)基本上设置在芯片的中心，延伸到芯片的顶表面中并且可从芯片的顶表面接近；多个侧孔(出口)设置在芯片的环形外部，延伸到芯片的顶表面中并且可从芯片的顶表面接近；多个通道延伸到芯片的底表面中并从中心孔延伸到侧孔，使中心孔和侧孔的流体连通。芯片可包括选自聚二甲基硅氧烷(PDMS)，PMMA(聚(甲基丙烯酸甲酯))，PS(聚苯乙烯)和PC(聚碳酸酯)的柔性或半刚性材料薄片。芯片可具有约1mm的厚度，其尺寸和形状设计可以适合培养皿，并且可以具有大约3cm的半径。中心孔可以延伸完全通过芯片，侧孔可以延伸完全通过芯片。中心孔可具有约3mm的直径和约4μl的体积。至少一些侧孔可具有约本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于单细胞分离的微流体等分芯片，其特征在于，包括：芯片，呈盘形，具有半径、中心、顶表面、底表面、外边缘和厚度；中心孔，设置在芯片的中心，延伸且连通到芯片的顶表面；侧孔，设有若干个，设置在芯片的环形外部，均延伸且连通到芯片的顶表面；以及微通道，设有若干个，用于连通侧孔及中心孔，延伸至芯片的底表面。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.01.26 US 15/006,6341.一种用于单细胞分离的微流体等分芯片，其特征在于，包括：芯片，呈盘形，具有半径、中心、顶表面、底表面、外边缘和厚度；中心孔，设置在芯片的中心，延伸且连通到芯片的顶表面；侧孔，设有若干个，设置在芯片的环形外部，均延伸且连通到芯片的顶表面；以及微通道，设有若干个，用于连通侧孔及中心孔，延伸至芯片的底表面。2.如权利要求1中所述的用于单细胞分离的微流体等分芯片，其特征在于，所述芯片采用选自聚二甲基硅氧烷，聚甲基丙烯酸甲酯，聚苯乙烯和聚碳酸酯的柔性或半刚性材料制成薄片。3.如权利要求1中所述的用于单细胞分离的微流体等分芯片，其特征在于，所述芯片厚度为1mm；或所述芯片的尺寸和形状适合放在培养皿中；或所述芯片半径为3cm。4.如权利要求1中所述的用于单细胞分离的微流体等分芯片，其特征在于，所述中心孔完全延伸穿过芯片；所述侧孔完全延伸穿过芯片。5.如权利要求1中所述的用于单细胞分离的微流体等分芯片，其特征在于，所述中心孔直径为3mm；所述中心孔具有4μl的体积。6.如权利要求1中所述的用于单细胞分离的微流体等分芯片，其特征在于，一部分或全部侧孔的直径为1.5mm；一部分或全部侧孔具有1μl的体积。7.如权利要求1中所述的用于单细胞分离的微流体等分芯片，其特征在于，所述侧孔包括第一侧孔组及第二侧孔组，所述第一侧孔组中的侧孔距离芯片中心的距离为r1；所述第二侧孔组的侧孔距离芯片中心的距离为r2，r2＞r1。8.如权利要求7中所述的用于单细胞分离的微流体等分芯片，其特征在于，所述第一侧孔组与第二侧孔组交错设置，每个第二侧孔组内的侧孔均设置在第一侧孔组内相邻的两个侧孔之间。9.如权利要求7中所述的用于单细胞分离的微流体等分芯片，其特征在于，所述第一侧孔组及第二侧孔组内的侧孔均匀地分布在芯片的外边缘。10.如权利要求1中所述的用于单细胞分离的微流体等分芯片，其特征在于，所述芯片的外边缘范围呈圆环形，该圆环内半径为r3，芯片半径为r，r3≥0.7r，该圆环外半径为r。11.如权利要求1中所述的用于单细胞分离的微流体等分芯片，其特征在于，所述微通道从中心孔沿径向连通至侧孔；或该通道仅部分延伸至芯片中；或该通道的宽度为30μm；或该通道的尺寸和形状适用于容纳从中...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦立东，张凯，
申请(专利权)人：秦立东，张凯，
类型：发明
国别省市：美国,US