预测或诊断脑恶性胶质瘤术后复发的生物标志物组合及其应用和试剂盒制造技术

本发明专利技术公开一种预测或诊断脑恶性胶质瘤术后复发的生物标志物组合及其应用和试剂盒，所述生物标志物存在于脑脊液的外泌体中，所述生物标志物组合包括：VEGF165、VEGF165b、miR‑21，所述生物标志物组合还包括：miR‑10b、miR‑485‑5p、EGFRvⅢ、VEGF‑A中的至少一种。其可以预测和诊断脑恶性胶质瘤在脑室、脑膜远处的复发转移和原位复发，准确度高。

Biomarker combination for predicting or diagnosing postoperative recurrence of malignant glioma and its application and kit

The invention discloses a combination of biomarkers for predicting or diagnosing recurrence of brain malignant glioma after operation and its application and kit. The biomarkers exist in the exosome of cerebrospinal fluid. The combination of biomarkers includes: VEGF165, VEGF165b, and Mir 21. The combination of biomarkers also includes: Mir 10b, Mir 21. At least 485 species of 5P, EGFRv III and VEGF A. It can predict and diagnose the recurrence, metastasis and in situ recurrence of malignant glioma in ventricles and meninges with high accuracy.

【技术实现步骤摘要】
预测或诊断脑恶性胶质瘤术后复发的生物标志物组合及其应用和试剂盒
本专利技术属于脑胶质瘤复发诊断和预测领域，具体涉及一种预测或诊断脑恶性胶质瘤术后复发的生物标志物组合及其应用和试剂盒，可以预测脑恶性胶质瘤在脑室、脑膜等远处的复发转移。
技术介绍
脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的肿瘤，发病率约占颅内肿瘤的45％，组织学分四级：I级、II级呈低恶性度，具有良性生物学特性，经过手术、放疗和化疗等综合治疗后，其5年生存率为45～60％；III级和IV级为高级别胶质瘤，特别是胶质母细胞瘤，由于呈弥漫浸润性生长，即使通过手术、放疗、化疗等综合治疗措施，中位生存期仅为18个月(III)及12个月(IV)。近年来随着分子生物学和基因组学研究进展、治疗方法的不断发展以及手术技术提高，部分患者生存期超过3年。最新临床研究发现此类患者(约占20％)术后会突然复发或向脑室、脑膜等远处转移，一旦发生，进展迅速。目前常规诊断脑胶质瘤方法如MR、CT、PET-CT等不能早期预测胶质瘤是否有原发部位及脑室、脑膜等部位转移倾向，因此提供一种预测脑恶性胶质瘤术后复发及脑室、脑膜等远处部位侵袭和转移的方法，提前干预该类患者对于改善脑胶质瘤疗效有着重要的意义。临床上常采用多种肿瘤标志物联合检测，实验证明同一肿瘤含有多种肿瘤标志物，而不同肿瘤或同种肿瘤的不同组织类型，除有共同的标志物外，也可有不同的标志物。对某一特定的肿瘤测定，可同时选择几种特异性较高的标志物，互相补充来提高诊断的阳性率。但是，鉴于标志物遴选和联合的复杂性，目前还没有针对于预测复发性脑恶性胶质瘤远处侵袭和/或转移的检测方法和检测专用试剂盒，目前的科研和临床工作中亟需此类标志物组合和试剂盒。
技术实现思路
针对现有技术的缺陷，本专利技术的目的之一在于提供一种预测或诊断脑恶性胶质瘤术后复发的生物标志物组合。本专利技术的目的之二在于提供上述生物标志物组合的应用。本专利技术的目的之三在于提供一种预测或诊断脑恶性胶质瘤术后复发的试剂盒。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种预测或诊断脑恶性胶质瘤术后复发的生物标志物组合，所述生物标志物存在于脑脊液的外泌体中，所述生物标志物组合包括：VEGF165、VEGF165b、miR-21。在上述生物标志物组合中，作为一种优选实施方式，所述生物标志物组合还包括：miR-10b、miR-485-5p、EGFRvⅢ、VEGF-A中的至少一种。上述生物标志物组合在制备用于预测或诊断脑恶性胶质瘤术后复发的试剂中的应用。在上述应用中，作为一种优选实施方式，所述脑恶性胶质瘤术后复发包括原位复发和远处转移复发。在上述应用中，作为一种优选实施方式，所述试剂是通过实时定量PCR法检测所述生物标志物组合中各种生物标志物表达量的试剂。一种预测或诊断脑恶性胶质瘤术后复发的试剂盒，所述试剂盒包括：用于检测所述生物标志物组合中各种生物标志物表达量的试剂。在上述试剂盒中，作为一种优选实施方式，所述试剂包括：用于扩增所述生物标志物组合中各种所述生物标志物编码基因的特异性引物或特异性探针。在上述试剂盒中，作为一种优选实施方式，各种所述生物标志物编码基因的特异性引物如下：用于扩增EGFRvⅢ编码基因的引物：上游引物序列如序列表中SEQIDNO:1所示，下游引物序列如序列表中SEQIDNO:2所示；用于扩增VEGF-A编码基因的引物：上游引物序列如序列表中SEQIDNO:3所示，下游引物序列如序列表中SEQIDNO:4所示；用于扩增VEGF165编码基因的引物：上游引物序列如序列表中SEQIDNO:5所示，下游引物序列如序列表中SEQIDNO:6所示；用于扩增VEGF165b编码基因的引物：上游引物序列如序列表中SEQIDNO:7所示，下游引物序列如序列表中SEQIDNO:8所示；用于扩增miR-21编码基因的引物：上游引物序列如序列表中SEQIDNO:9所示，下游引物序列如序列表中SEQIDNO:10所示；用于扩增miR-10b编码基因的引物：上游引物序列如序列表中SEQIDNO:11所示，下游引物序列如序列表中SEQIDNO:12所示；用于扩增miR-485-5p编码基因的引物：上游引物序列如序列表中SEQIDNO:13所示，下游引物序列如序列表中SEQIDNO:14所示。在上述应用中，作为一种优选实施方式，所述试剂盒还包括：外泌体提取试剂；外泌体RNA提取试剂；逆转录试剂；以及实时定量PCR扩增试剂。在上述应用中，作为一种优选实施方式，所述试剂盒还包括：阴性对照和阳性对照；所述阴性对照为ddH2O，所述阳性对照分别为含有EGFRvⅢ、VEGF-A、VEGF165、VEGF165b、miR-21、miR-10b、miR-485-5p编码基因的核苷酸碱基序列的质粒。相比现有技术，本专利技术具有如下有益效果：1、本专利技术通过检测脑脊液外泌体中的miRNA表达水平、EGFR的突变(EGFRvⅢ)以及VEGF-A的可变剪切来预测恶性脑胶质瘤术后复发的风险，特别是远处转移复发的预测，为此类脑胶质瘤患者的治疗提供临床依据。2、本专利技术抽取脑胶质瘤患者的脑脊液，提取其外泌体，RT-PCR方法鉴定外泌体EGFRvⅢ、VEGF-A、VEGF-A中VEGF165b与VEGF165的比率、以及miR-21、miR-10b、miR-485-5p的表达，预测恶性脑胶质瘤术后远处着床侵袭和转移的风险。3、本专利技术的方法简便易行，预测或诊断恶性脑胶质瘤术后远处着床侵袭和转移的风险的准确率高。具体实施方式下面结合实施例进一步说明本专利技术，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本专利技术，并非用于限制本专利技术。除非特别指明，本专利技术所使用的试剂和材料均可通过商业途径获得。除非另有说明，本申请的实施将采用常规的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和基因学技术，其均在本领域常规技术手段的范围内。在文献中对此类技术进行了详细说明如MolecularCloning:ALaboratoryManual，第二版(Sambrook等，1989)；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait，1984版)；AnimalCellCulture(R.I.Freshney，1987版)；MethodsinEnzymology丛书(美国学术出版社有限公司)；CurrentProtocolsinMolecularBiology(F.M.Ausubel等，1987版，和定期更新)；PCR:ThePolymeraseChainReaction(Mullis等，1994版)。本申请中使用的引物、探针和试剂盒可以采用本领域公知的标准技术制备。除非另有定义，本申请所使用的技术和科学术语与本专利技术所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的含义。研究表明，脑胶质瘤复发和转移与脑胶质瘤细胞分泌到脑脊液中的外泌体密切相关。通过分析其外泌体的成分，建立预测脑恶性胶质瘤术后复发及脑室、脑膜远处转移倾向的方法，为提早干预治疗脑胶质瘤，延长脑胶质瘤患者的生存期具有重要意义。脑胶质瘤脑脊液中的外泌体，主要成分包括miRNA、蛋白如VEGF-A、EGFRvⅢ等，其中人类胶质母细胞瘤外泌体miRNA包括：miR-21(NCBI的geneID：406991)、mi本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种预测或诊断脑恶性胶质瘤术后复发的生物标志物组合，其特征在于，所述生物标志物存在于脑脊液的外泌体中，所述生物标志物组合包括：VEGF165、VEGF165b、miR‑21。

【技术特征摘要】
1.一种预测或诊断脑恶性胶质瘤术后复发的生物标志物组合，其特征在于，所述生物标志物存在于脑脊液的外泌体中，所述生物标志物组合包括：VEGF165、VEGF165b、miR-21。2.根据权利要求1所述的生物标志物组合，其特征在于，所述生物标志物组合还包括：miR-10b、miR-485-5p、EGFRvⅢ、VEGF-A中的至少一种。3.权利要求1或2所述生物标志物组合在制备用于预测或诊断脑恶性胶质瘤术后复发的试剂中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述脑恶性胶质瘤术后复发包括原位复发和远处转移复发。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂是通过实时定量PCR法检测权利要求1或2所述生物标志物组合中各种生物标志物表达量的试剂。6.一种预测或诊断脑恶性胶质瘤术后复发的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括：用于检测权利要求1或2所述生物标志物组合中各种生物标志物表达量的试剂。7.根据权利要求6所述试剂盒，其特征在于：所述试剂包括：用于扩增所述生物标志物组合中各种所述生物标志物编码基因的特异性引物或特异性探针。8.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于：各种所述生物标志物编码基因的特异性引物如下：用于扩增EGFRvⅢ编码基因的引物：上游引物序列如序列表中SEQIDNO:1所示，下游引物序列如序列表中SEQIDNO:2所示；用于扩增VEGF-A编码基...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘福生，张俊文，苏晓东，张梦梦，金贵善，米蕊芳，
申请(专利权)人：北京市神经外科研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11