SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系及其构建方法技术

本发明专利技术属于用于植物转基因技术领域，公开了一种SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系及其构建方法，所述SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系为OE21和OE41。所述SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系的构建方法包括：用根癌农杆菌浸染花序的方法获得SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系。本发明专利技术进行了一次Kan筛选，结果证明选用的过表达株系OE21和OE41能够在Kan的MS平板上萌发生长，而野生型和syta突变体只能萌发，子叶不能变绿，也不能继续生长。说明过表达株系OE21和OE41是遗传稳定的转基因株系。

Transgenic Arabidopsis strain overexpressing SYTA gene and its construction method

The invention belongs to the field of plant genetically modified technology, and discloses a genetically modified Arabidopsis thaliana strain overexpressing SYTA gene and its construction method. The genetically modified Arabidopsis strains overexpressing SYTA gene are OE21 and OE41. The construction method of the transgenic Arabidopsis thaliana strain with excessive expression of SYTA gene includes: obtaining the transgenic Arabidopsis strain with excessive expression of SYTA gene by using the method of Inflorescence Infection by Agrobacterium tumefaciens. The present invention has conducted a Kan screening, and the results show that the selected overexpression strains OE21 and OE41 can germinate and grow on Kan's MS plate, while wild type and syta mutant can only germinate, cotyledons can not turn green, and can not continue to grow. Overexpression lines OE21 and OE41 are genetically stable transgenic lines.

【技术实现步骤摘要】
SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系及其构建方法
本专利技术属于用于植物细胞
，尤其涉及一种SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系及其构建方法。
技术介绍
目前，业内常用的现有技术是这样的：转基因技术的原理是将人工分离和修饰过的优质基因，导入到生物体基因组中，从而达到改造生物的目的。由于导入基因的表达，引起生物体的性状，可遗传的修饰改变。常用的遗传转化方法有农杆菌介导转化法、基因枪法、花粉管通道法等。农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。在用农杆菌浸染花序的方法构建转基因植物时，首先是获得目的基因的片段，再连接到适宜的质粒上形成转基因载体，再将载体转入农杆菌并筛选阳性克隆，然后将阳性克隆扩大培养并侵染受体植株的花序，从而导入受体植物细胞，再收获被侵染的拟南芥种子并繁殖得到T1代，最后用基因鉴定等方法进行验证，以达到预想的特性，满足人们的要求。由于每个技术环节的严谨和准确决定着得到的转基因株系具有目的基因的专一性和特异性，以及稳定的转化率，而现有技术往往比较笼统，不贴合，这是造成转化率降低和转基因株系性状不稳定的主要原因。因此，对每个步骤进行技术优化非常必要，如质粒的选择和改造，目的基因和质粒的连接，农杆菌菌种选择和阳性克隆的准确性，浸染花序的方法和转基因植株的培养方法，转基因株系的检测鉴定等。综上所述，现有技术存在的问题是：(1)构建的转基因载体中，目的基因不能正常或大量表达。(2)传统小提得到的质粒浓度过低而不能满足下一步转化农杆菌的需要。(3)在筛选农杆菌阳性克隆时，常出现假阳性克隆，从而影响筛选和下一步判断的准确性。(4)单纯依靠抗生素筛选，忽视了遗传本质，造成筛选不准确。解决上述技术问题的难度和意义：转基因技术应用广泛，通过转基因技术可以验证基因功能，从而助推生物学理论的发展，同时具有新性状的转基因株系丰富了农业生产的种质资源库。而载体的构建，农杆菌转化和阳性克隆的筛选，都是转基因技术的重要环节，这些环节出现技术问题，都会造成转基因株系筛选不准确，构建不成功，进而根本不能得到转基因株系。目前有一些技术可以解决个别问题，但缺乏系统性和针对性。如Silica吸附法可以大量提取质粒，但是没有进一步的细化，而只注重是农杆菌浸染法还是基因枪法这样的大类的区别。另一方面，由于转基因技术本身存在很高的难度，如目的基因和载体的合理连接，以保证目的基因的正常表达和大量表达；如构建载体的质粒浓度要达到技术要求的浓度；转化和筛选株系时，阳性克隆的准确判断等等。更重要的是，在技术方面的选择直接影响转基因技术的安全性。因此，用科学、安全，稳定性强、并且操作可行性强，可重复的公开技术来发展和完善转基因技术迫在眉睫。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系及其构建方法。本专利技术是这样实现的，一种SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系，所述SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系为OE21和OE41。本专利技术的另一目的在于提供一种所述SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系的构建方法，所述SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系的构建方法包括：用根癌农杆菌浸染花序的方法获得SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系。进一步，所述SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系的构建方法包括以下步骤：步骤一，植物培养，将春化处理的拟南芥种子播种于营养土和蛭石的混合物中，置于相对湿度60％，培养温度22-25℃，16h光照/8h黑暗条件下培养；步骤二，KCl法制备E.coilDH5α感受态细胞；步骤三，转基因载体pBI121-35S：SYTA的活化和鉴定；步骤四，Silica吸附法大量提取质粒；步骤五，农杆菌的活化和鉴定，在含有三种抗生素的LB平板上，划线培养农杆菌EHA105菌株，48h后选择生长良好的单菌落；步骤六，CaCl2法制备农杆菌感受态细胞；步骤七，pBI121-35S：SYTA载体转化农杆菌；步骤八，阳性农杆菌转化子的鉴定，随机挑取重组平板上的农杆菌单菌落接种于LB+Str+Kan液体培养基中进行振荡培养，培养后，以菌液作模板，用35Sup引物和SYTAdn引物进行PCR扩增以鉴定重组质粒是否转入；步骤九，农杆菌介导的遗传转化；步骤十，转基因植株T1代的获得及分离比的鉴定；步骤十一，转基因植株T1代的DNA水平、RNA水平及蛋白水平的鉴定。进一步，所述步骤二具体包括：在平板上挑取E.coilDH5α单菌落于10mL的LB培养基中，于37℃，225rpm摇床上振荡培养过夜；在50mL的LB培养基中加入0.5mL活化的DH5α培养液，于18℃，225rpm摇床上振荡培养过夜，测定OD600为0.6时终止振荡；把培养的菌液在冰上放置10min后倒入4℃预冷的离心管中，在4℃，3500rpm下离心10min；倒掉上清，在菌体沉淀中加入4℃预冷的TB缓冲液15mL并混匀，冰上放置10min后，再于4℃，3500rpm下离心5min；弃上清，加入TB缓冲液4mL，混匀后再加入DMSO280μL，冰浴10min后分装于EP管中；用封口膜封装每个EP管，并在液氮中处理使其冻透，再置于-80℃冰箱内长期保存。进一步，所述步骤三具体包括：pBI121-35S:SYTA质粒中SYTA基因的N端连接35S强启动子，C端带有HA标签；将该质粒转化至E.coliDH5α感受态细胞，以长出的菌落为模板，用35Sup引物和SYTAdn引物进行PCR检测；电泳检测为阳性的菌落扩大培养，Silica法提取质粒，酶切检测并基因测序验证。进一步，所述步骤四具体包括：取培养至对数生长后期的含目标质粒的细菌培养液500mL，分至50mL离心管中，4℃下6000g离心5min，弃上清；按1：50的比例加入溶液I，振荡使菌体重悬；加入新配制的溶液II，颠倒混匀后冰浴5-8min；再加入0℃预冷的溶液III，摇动混匀后冰浴10min，使之出现白色絮状沉淀；4℃，8000rpm下离心15min，取上清至干净的离心管，加入0.6倍体积的异丙醇，-20℃条件下静置沉淀1h；4℃，8000rpm下离心15min，弃上清，加入TE缓冲液2mL溶解沉淀；再向溶解的沉淀中加入5mol/L的LiCl8mL，混匀后于4℃，10000g下离心10min；移出上清，加入10mL的Bindmix，室温培养3min；再次混合，于2000rpm下离心3min；弃上清，加入10mL的Bindmix，于2000rpm下离心3min；弃上清，加入50％的乙醇20mL，于2000rpm下离心3min；在室温下干燥沉淀15min；用500μLTE重悬沉淀，并在65℃条件下培养3min后于10000rpm下离心5min；移出上清，用于下一步或冷冻保存。进一步，所述步骤六具体包括：挑取农杆菌EHA105单菌落接种到LB+Str的液体培养基中，并于28℃振荡培养过夜；在50mL的LB+St本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系的构建方法，其特征在于，所述SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系的构建方法包括：用根癌农杆菌浸染花序的方法获得SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系。

【技术特征摘要】
1.一种SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系的构建方法，其特征在于，所述SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系的构建方法包括：用根癌农杆菌浸染花序的方法获得SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系。2.如权利要求1所述的SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系的构建方法，其特征在于，所述SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系的构建方法包括以下步骤：步骤一，植物培养，将春化处理的拟南芥种子播种于营养土和蛭石的混合物中，置于相对湿度60％，培养温度22-25℃，16h光照/8h黑暗条件下培养；步骤二，KCl法制备E.coilDH5α感受态细胞；步骤三，转基因载体pBI121-35S：SYTA的活化和鉴定；步骤四，Silica吸附法大量提取质粒；步骤五，农杆菌的活化和鉴定，在含有三种抗生素的LB平板上，划线培养农杆菌EHA105菌株，48h后选择生长良好的单菌落；步骤六，CaCl2法制备农杆菌感受态细胞；步骤七，pBI121-35S：SYTA载体转化农杆菌；步骤八，阳性农杆菌转化子的鉴定，随机挑取重组平板上的农杆菌单菌落接种于LB+Str+Kan液体培养基中进行振荡培养，培养后，以菌液作模板，用35Sup引物和SYTAdn引物进行PCR扩增以鉴定重组质粒是否转入；步骤九，农杆菌介导的遗传转化；步骤十，转基因植株T1代的获得及分离比的鉴定；步骤十一，转基因植株T1代的DNA水平、RNA水平及蛋白水平的鉴定。3.如权利要求2所述的SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系的构建方法，其特征在于，所述步骤二具体包括：在平板上挑取E.coilDH5α单菌落于10mL的LB培养基中，于37℃，225rpm摇床上振荡培养过夜；在50mL的LB培养基中加入0.5mL活化的DH5α培养液，于18℃，225rpm摇床上振荡培养过夜，测定OD600为0.6时终止振荡；把培养的菌液在冰上放置10min后倒入4℃预冷的离心管中，在4℃，3500rpm下离心10min；倒掉上清，在菌体沉淀中加入4℃预冷的TB缓冲液15mL并混匀，冰上放置10min后，再于4℃，3500rpm下离心5min；弃上清，加入TB缓冲液4mL，混匀后再加入DMSO280μL，冰浴10min后分装于EP管中；用封口膜封装每个EP管，并在液氮中处理使其冻透，再置于-80℃冰箱内长期保存。4.如权利要求2所述的SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系的构建方法，其特征在于，所述步骤三具体包括：pBI121-35S:SYTA质粒中SYTA基因的N端连接35S强启动子，C端带有HA标签；将该质粒转化至E.coliDH5α感受态细胞，以长出的菌落为模板，用35Sup引物和SYTAdn引物进行PCR检测；电泳检测为阳性的菌落扩大培养，Silica法提取质粒，酶切检测并基因测序验证。5.如权利要求2所述的SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系的构建方法，其特征在于，所述步骤四具体包括：取培养至对数生长后期的含目标质粒的细菌培养液500mL，分至50mL离心管中，4℃下6000g离心5min，弃上清；按1：50的比例加入溶液I，振荡使菌体重悬；加入新配制的溶液II，颠倒混匀后冰浴5-8min；再加入0℃预冷的溶液III，摇动混匀后冰浴10min，使之出现白色絮状沉淀；4℃，8000rpm下离心15min，取上清至干净的离心管，加入0.6倍体积的异丙醇，-20℃条件下静置沉淀1h；4℃，8000rpm下离心15min，弃上清，加入TE缓冲液2mL溶解沉淀；再向溶解的沉淀中加入5mol/L的LiCl8mL，混匀后于4℃，10000g下离心10min；移出上清，加入10mL的Bindmix，室温培养3min；再次混合，于2000rpm下离心3min；弃上清，加入10mL的Bindmix...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫秋洁，
申请(专利权)人：闫秋洁，
类型：发明
国别省市：四川,51