催化合成可可碱的酶组合物及其在生物制备可可碱中的应用制造技术

本发明专利技术提供一种催化合成可可碱的酶组合物和生物制备可可碱的方法，属于可可碱制备技术领域。本发明专利技术提供了催化合成可可碱的酶组合物，包括NdmA酶和NdmD酶；所述NdmA酶的一级结构氨基酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；所述NdmD酶的一级结构氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。采用本发明专利技术提供的酶组合物对咖啡因进行催化反应得到可可碱，具有转化率高的特点，对咖啡因的转化率大于90％。本发明专利技术提供的酶组合物具有较好的工业化应用前景。

Enzymatic composition for the synthesis of theobromine and its application in biological preparation of theobromine

The invention provides an enzymatic composition for catalytic synthesis of theobromine and a method for biological preparation of theobromine, belonging to the technical field of theobromine preparation. The present invention provides enzymatic compositions for catalytic synthesis of theobromine, including NdmA and NdmD enzymes; the primary structural amino acid sequence of the NdmA enzymes is shown in the sequence table SEQ ID No.1; and the primary structural amino acid sequence of the NdmD enzymes is shown in the sequence table SEQ ID No.2. Theobromine can be obtained by catalytic reaction of caffeine with the enzyme composition provided by the invention, which has the characteristics of high conversion rate and over 90% conversion rate of caffeine. The enzyme composition provided by the invention has good industrial application prospect.

【技术实现步骤摘要】
催化合成可可碱的酶组合物及其在生物制备可可碱中的应用
本专利技术属于可可碱制备
，具体涉及一种催化合成可可碱的酶组合物和生物制备可可碱的方法。
技术介绍
可可碱(Theobromine)，是一种甲基黄嘌呤类生物碱。主要存在于可可树和巧克力中(NarendraKS,TrilokCB,NamrathaS,etal.ProductionoftheobrominefromPsudeomonassp.IntResJPharm,2013,4(2):151-154)，呈白色单斜形针状结晶性粉末，略有苦味。可可碱可以作为磷酸二酯酶抑制剂，弱腺苷受体拮抗剂，具有较强和持久的利尿作用，有较强的扩张冠状动脉、兴奋心肌、松弛气管平滑肌的作用。可可碱也是一种重要的药物中间体，如己酮可可碱对脑血管疾病、糖尿病并发症有显著疗效。可可碱在国内主要作为复方制剂销售，可以制成止咳平喘药物。目前，可可碱主要是从可可豆或可可豆壳中抽提或采用化学合成方法获得，但由于可可豆或可可豆壳中可可碱的含量仅1％左右，化学抽提不仅效率低，而且大量有机溶剂的使用也造成安全上的隐患和环境的污染。而化学合成法是以甲基脲和氰乙酸乙酯为起始原料经缩合、亚硝化、还原、甲酰化、甲基化环合反应，得到粗品，再重结晶而得到纯品，因此，该方法反应步骤多、反应过程复杂、副反应多且易造成环境污染。而生物催化法以其环境友好、反应条件温和、对底物专一等优点逐渐成为了可可碱制备最具前景的研究方向。可可碱，即3,7-二甲基黄嘌呤，其连同副黄嘌呤(Paraxanthine)和茶碱(Theophylline)，均属咖啡因(Caffeine)的去甲基代谢产物，即对咖啡因(1,3,7-三甲基黄嘌呤)分别脱去了N-1、N-3、N-7位甲基。因此，可可碱与咖啡因的区别便在于1位是否甲基化。于是，利用生物催化法制备可可碱的关键，便在于寻找可以专一性降解咖啡因N-1位甲基的微生物或生物酶制剂。目前，国内外关于生物催化方法合成可可碱的相关报道很少。1994年，Yasuhisa等报道从恶臭假单胞菌352株中可分离具有脱甲基活性的酶混合物(YasuhisaA,ToshihiroK,HideakiY.EnzymesinvolvedintheobromineproductionfromcaffeinebyPseudomonasputidaNo.352.BiosciBiotechBiochem,1994,58(12):2303-2304)。2001年Sideso等也从恶臭假单胞菌分离到咖啡因脱甲基活性酶复合体(SidesoOFP,MarvierAC,KaterelosNA,etal.Thecharacteristicsandstabilizationofacaffeinedemethylaseenzymecomplex.IntJFoodSciTechnol,2001,36:693-698)。2011年Gummadi等报道其催化相关酶主要为咖啡因脱甲基化酶，属于单加氧酶，这类酶具有不同位置脱甲基特异性(GummadiSN,BhavyaB.EnhanceddegradationofcaffeineandcaffeinedemethylaseproductionbyPseudomonassp.inbioreactorsunderfed-batchmode.ApplMicrobiolBiotechnol,2011,91:1007-1017)。研究表明，在生物催化咖啡因脱甲基生成可可碱的过程中，需要耦合专一配对的还原酶对其进行供氢研究并大量消耗辅酶NADH，而且作为单加氧酶还需要氧气参与反应。去甲基化酶与还原酶含有一个或多个Fe-S中心簇，常规分离表达困难，并且耦合辅酶循环用酶对其整个催化体系要求更高，因而少有能直接应用于工业化生产的生物催化法研究。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种催化合成可可碱的酶组合物和生物制备可可碱的方法，提高咖啡因的转化率。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种催化合成可可碱的酶组合物，包括NdmA酶和NdmD酶；所述NdmA酶的一级结构氨基酸序列如序列表SEQIDNo.1所示；所述NdmD酶的一级结构氨基酸序列如序列表SEQIDNo.2所示。优选的，所述NdmA酶和NdmD酶的质量比为1：1～3；所述NdmA酶的比活力为1～1000U/g；所述NdmD酶的比活力为1～1000U/g。本专利技术提供了一套编码所述酶组合物的基因，NdmA酶的编码基因的核苷酸序列具有如序列表SEQIDNo.3所示；NdmD酶的核苷酸序列如序列表SEQIDNo.4所示。本专利技术提供了一种催化合成可可碱的重组载体组合物，所述重组载体组合物包括含有所述基因中NdmA酶的编码基因的重组载体质粒-NdmA和含有所述基因中NdmD酶的编码基因的重组载体质粒-NdmD。本专利技术提供了催化合成可可碱的重组菌组合物，所述重组菌组合物包括含有所述重组载体组合物中质粒-NdmA的重组菌和含有所述重组载体组合物中质粒-NdmD的重组菌。本专利技术提供了所述酶组合物、所述的基因、所述的重组载体组合物或所述的重组菌组合物在生物制备可可碱中的应用。优选的，所述生物制备可可碱的方法，包括以下步骤：(1)构建咖啡因反应体系，所述反应体系中含有底物咖啡因0.1～10g/L，NADH0.1～10mmol/L，催化剂0.1～1g/mL，硫酸亚铁铵0.1～10mmol/L，过氧化氢酶1～100U/mL和pH值为6.5～7.5的磷酸缓冲液；所述催化剂包括所述的酶组合物或所述的重组菌组合物；(2)将所述反应体系在25～35℃，转速为150～200rpm的条件反应，得到可可碱。优选的，所述反应体系中含有底物咖啡因1g/L，NADH1mmol/L，催化剂0.1g/mL，硫酸亚铁铵1mmol/L，过氧化氢酶100U/mL和20mmol/LpH值为7.0的磷酸缓冲液。优选的，反应的温度为30℃，反应的的转速为180rpm。优选的，所述重组菌需求量为0.1-1g/mL。本专利技术提供的催化合成可可碱的酶组合物，所述酶组合物包括NdmA酶和NdmD酶；所述NdmA酶的一级结构氨基酸序列如序列表SEQIDNo.1所示；所述NdmD酶的一级结构氨基酸序列如序列表SEQIDNo.2所示。采用本专利技术提供的酶组合物对咖啡因进行催化反应得到可可碱，具有转化率高的特点，对咖啡因的转化率大于90％。本专利技术提供的酶组合物具有较好的工业化应用前景。本专利技术提供了所述酶组合物、所述的基因、所述的重组载体组合物或所述的重组菌组合物在生物制备可可碱中的应用。本专利技术采用生物催化法生产可可碱，以其环境友好、反应专一性高、产物纯度高易分离等优点已成为未来可可碱研发生产的热点。本专利技术提供的应用具有新型、高效、稳定的特点，通过控制反应的温度和搅拌速度，获得较高的可可碱转化率，对于工业制备可可碱具有重要的研究意义。附图说明图1为NdmA的电泳图；图2为NdmD的电泳图；图3为催化生成可可碱反应的TLC检测结果；图4为催化生成可可碱反应的液相检测结果；图5为NdmA和NdmD的配比对生物催化合成可可碱的影响；图6为不同pH值对生物催化合成可可碱的影响；图7为不同温度值对生物催化合成本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种催化合成可可碱的酶组合物，其特征在于，包括NdmA酶和NdmD酶；所述NdmA酶的一级结构氨基酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；所述NdmD酶的一级结构氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种催化合成可可碱的酶组合物，其特征在于，包括NdmA酶和NdmD酶；所述NdmA酶的一级结构氨基酸序列如序列表SEQIDNo.1所示；所述NdmD酶的一级结构氨基酸序列如序列表SEQIDNo.2所示。2.根据权利要求1所述的酶组合物，其特征在于，所述NdmA酶和NdmD酶的质量比为1：1～3；所述NdmA酶的比活力为1～1000U/g；所述NdmD酶的比活力为1～1000U/g。3.一套编码权利要求1所述酶组合物的基因，其特征在于，NdmA酶的编码基因的核苷酸序列具有如序列表SEQIDNo.3所示；NdmD酶的核苷酸序列如序列表SEQIDNo.4所示。4.一种催化合成可可碱的重组载体组合物，其特征在于，所述重组载体组合物包括含有权利要求3所述基因中NdmA酶的编码基因的重组载体质粒-NdmA和含有权利要求3所述基因中NdmD酶的编码基因的重组载体质粒-NdmD。5.一种催化合成可可碱的重组菌组合物，其特征在于，所述重组菌组合物包括含有权利要求4所述重组载体组合物中质粒-NdmA的重组菌和含有权利要求4所述重组载体组合物中质粒-NdmD的重组菌。6.权利要求1或2所述酶组...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾振华，宋水山，赵芊，黄亚丽，黄媛媛，
申请(专利权)人：河北省科学院生物研究所，
类型：发明
国别省市：河北,13