新型CRISPR相关转座酶及其用途制造技术

本文提供用于修饰靶标DNA序列的系统、方法和组合物。更特定来说，提供用于用CRISPR相关转座酶编辑真核细胞中的基因组DNA的系统、方法和组合物。也提供编码一种或多种CRISPR相关转座酶的载体和载体系统以及用于设计和使用此类载体的方法。也提供用于鉴定和验证新型CRISPR相关转座酶的方法。

Novel CRISPR related transposase and its uses

Systems, methods and compositions for modifying target DNA sequences are provided in this paper. More specifically, systems, methods and compositions for editing genomic DNA in eukaryotic cells with CRISPR-related transposases are provided. Carriers and carrier systems encoding one or more CRISPR-related transposases and methods for designing and using such carriers are also provided. A method for identifying and validating new CRISPR related transposable enzymes is also provided.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新型CRISPR相关转座酶及其用途相关申请的交叉引用以及序列表的并入本申请要求2015年12月29日提交的题为NOVELRNA-GUIDEDDNANUCLEASESANDUSESTHEREOF的美国临时专利申请号62/272,441的优先权，所述美国临时专利申请整体并入。大小是723,030字节(在MSWindows操作系统中测量)并且于2015年12月16日创建并于2015年12月29日与美国临时专利申请号62/272,441一起提交的文件“61701-0000-US_ST25.txt”中含有的序列表以引用的方式整体并入本文。序列表的计算机可读形式通过电子提交来与本申请一起提交，并且以引用的方式整体并入本申请中。序列表含于名为61701-0000-WO_ST25.txt的文件中，所述文件大小是4,394,235字节(在MSWindows操作系统中测量)，并且于2016年12月29日创建。背景CRISPR(成簇规律间隔短回文重复序列)是见于细菌和古细菌的基因组中的含有多个短正向重复序列的基因座。CRISPRRNA(crRNA)与CRISPR相关(Cas)效应蛋白缔合以形成识别外来核酸的CRISPR-Cas系统。CRISPR系统是细菌和古细菌的适应性免疫系统的一部分，通过以序列依赖性方式裂解外来DNA来保护它们对抗侵袭性核酸诸如病毒。免疫性通过在CRISPR基因座的近端在两个邻近重复序列之间整合侵袭性DNA的称为间隔子的短片段来获得。CRISPR阵列在后续与侵袭性核酸相遇期间被转录，并且被加工成长度是约40nt的小干扰CRISPRRNA(crRNA)，其与反式活化CRISPRRNA(tracrRNA)缔合以将CRISPR相关核酸酶引导至侵袭性核酸。CRISPR/Cas9效应物复合物裂解侵袭性DNA中称为原间隔子的同源性双链DNA序列。裂解的先决条件是在靶标DNA的下游存在保守原间隔子邻近基序(PAM)，对于Cas9，所述基序通常具有序列5′-NGG-3′，但较不常见地具有序列NAG。特异性由crRNA中的“种子序列”提供，所述种子序列位于PAM上游约12个碱基，必须能够与靶标序列杂交。Cpf1，一种V型Cas效应蛋白，以与Cas9类似的方式起作用，但Cpf1不需要tracrRNA。将CRISPR-Cas系统分成两个类别：1类CRISPR系统，再分成I、III和IV型，并且1类系统利用多个Cas蛋白与crRNA一起形成复合物；以及2类CRISPR系统，再分成II和V型，利用单一Cas蛋白与crRNA一起形成能够进行序列特异性基因组修饰的复合物。概述若干实施方案涉及一种包含可操作地连接于编码CRISPR相关转座酶的多核苷酸的异源性启动子的重组核酸，其中所述CRISPR相关转座酶包含选自由SEQIDNO:124-246和275-287组成的组的氨基酸序列或其片段。若干实施方案涉及一种包含可操作地连接于编码CRISPR相关转座酶的多核苷酸的异源性启动子的重组核酸，其中所述CRISPR相关转座酶与包含选自SEQIDNO:124-246和275-287的氨基酸序列的CRISPR相关转座酶具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同源性或同一性。在一些实施方案中，提供一种包含重组核酸的载体，所述重组核酸包含可操作地连接于编码具有选自由SEQIDNO:124-246和275-286组成的组的氨基酸序列的CRISPR相关转座酶的异源性启动子的多核苷酸。在一些实施方案中，提供一种包含重组核酸的载体，所述重组核酸包含可操作地连接于编码CRISPR相关转座酶的异源性启动子的多核苷酸，其中所述CRISPR相关转座酶与包含选自SEQIDNO:124-246和275-287的氨基酸序列的CRISPR相关转座酶具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同源性或同一性。若干实施方案涉及一种包含可操作地连接于编码CRISPR相关转座酶的多核苷酸的异源性启动子的重组核酸，其中所述多核苷酸包含选自由SEQIDNO:1-123和604-627组成的组的核酸序列或其片段。若干实施方案涉及一种包含可操作地连接于编码CRISPR相关转座酶的多核苷酸的异源性启动子的重组核酸，其中所述多核苷酸包含选自由SEQIDNO:2020-2699组成的组的核酸序列或其片段。若干实施方案涉及一种包含可操作地连接于编码CRISPR相关转座酶的多核苷酸的异源性启动子的重组核酸，其中所述多核苷酸包含选自由SEQIDNO:2700-3379组成的组的核酸序列或其片段。若干实施方案涉及一种包含可操作地连接于编码CRISPR相关转座酶的多核苷酸的异源性启动子的重组核酸，其中所述多核苷酸包含与选自SEQIDNO:1-123、604-627和2020-3379的序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的序列。若干实施方案涉及一种包含重组核酸的载体，所述重组核酸包含可操作地连接于编码CRISPR相关转座酶的异源性启动子的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含选自SEQIDNO:1-123、604-627和2020-3379的序列。在一些实施方案中，载体包含重组核酸，所述重组核酸包含异可操作地连接于编码CRISPR相关转座酶的异源性启动子的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与选自SEQIDNO:1-123、604-627和2020-3379的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。若干实施方案涉及一种包含重组核酸的细胞，所述重组核酸包含可操作地连接于编码CRISPR相关转座酶的异源性启动子的多核苷酸，其中所述CRISPR相关转座酶包含选自由SEQIDNO:124-246和275-287组成的组的氨基酸序列或其片段。若干实施方案涉及一种包含重组核酸的细胞，所述重组核酸包含可操作地连接于编码CRISPR相关转座酶的异源性启动子的多核苷酸，其中所述CRISPR相关转座酶与包含选自SEQIDNO:124-246和275-287的氨基酸序列的CRISPR相关转座酶具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同源性或同一性。在一些实施方案中，重组核酸包含与选自SEQIDNO:1-123、604-627和2020-3379的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同源性的核酸序列。在一些实施方案中，重组核酸在细胞中短暂表达。在一些实施方案中，将重组核酸整合至细胞的基因组中。在一些实施方案中，将重组核酸整合至细胞的B染色体中。在一些实施方案中，细胞是原核细胞。在一些实施方案中，细胞是真核细胞。在一些实施方案中，真核细胞是植物细胞。在一些实施方案中，真核细胞是藻类细胞。在一些实施方案中，真核细胞是哺乳动物细胞。在一个方面，本公开提供一种用于对靶标核酸序列进行序列特异性修饰的系统，其包含(a)引导RNA或编码引本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组核酸，其包含可操作地连接于编码具有选自由SEQ ID NO:124‑246和275‑287组成的组的氨基酸序列的CRISPR相关转座酶的多核苷酸的异源性启动子。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.12.29 US 62/272,4411.一种重组核酸，其包含可操作地连接于编码具有选自由SEQIDNO:124-246和275-287组成的组的氨基酸序列的CRISPR相关转座酶的多核苷酸的异源性启动子。2.如权利要求1所述的重组核酸，其中所述CRISPR相关转座酶：a.来自选自由以下组成的组的细菌：赖氨酸芽孢杆菌属某种、短芽孢杆菌属某种、鞘氨醇杆菌属某种、水杆菌属某种、芽孢杆菌属某种、金黄杆菌属某种、鞘氨醇单胞菌属某种、双头菌属某种、类芽孢杆菌属某种、链霉菌属某种和寡养单胞菌属某种；b.来自选自由以下组成的组的细菌：短短芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、类短短芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、韦氏芽孢杆菌、粪肠球菌、迟钝水杆菌、玫瑰色新鞘氨醇杆菌、嗜甲氨基双头菌、解硫胺素类芽孢杆菌、缓病类芽孢杆菌和土地类芽孢杆菌；c.在细菌基因组中与CRISPR基因座关联；d.与CRISPR基因座位于同一操纵子中；e.位于CRISPR基因座的2.5千碱基内；f.由与选自由SEQIDNO:1-123、604-627和2020-3379组成的组的序列具有至少90％同一性的核苷酸序列编码；或g.(a)、(b)、(c)、(d)、(e)和(f)的任何组合。3.如权利要求1所述的重组核酸，其进一步包含至少一个编码能够与靶标序列杂交的引导RNA的多核苷酸，其中所述引导RNA与所述CRISPR相关转座酶形成复合物。4.如权利要求3所述的重组核酸，其中所述至少一个编码引导RNA的多核苷酸可操作地连接于第二启动子。5.如权利要求1所述的重组核酸，其进一步包含至少一个编码供体多核苷酸的多核苷酸。6.如权利要求5所述的重组核酸，其中所述至少一个编码供体多核苷酸的多核苷酸可操作地连接于第二启动子。7.如权利要求1所述的重组核酸，其中编码所述CRISPR相关转座酶的所述多核苷酸进一步编码至少一个核定位信号(NLS)。8.一种载体，其包含如权利要求1-7中任一项所述的重组核酸。9.一种真核细胞，其包含如权利要求1-7中任一项所述的重组核酸。10.一种用于对靶标核酸序列进行序列特异性修饰的非天然存在的系统，其包含(a)一个或多个引导RNA或编码所述一个或多个引导RNA的DNA分子，其中所述一个或多个引导RNA能够与所述靶标核酸序列杂交，和(b)具有选自由SEQIDNO:124-246和275-287组成的组的氨基酸序列的CRISPR相关转座酶或编码所述CRISPR相关转座酶的多核苷酸，其中所述一个或多个引导RNA和所述CRISPR相关转座酶不一起天然存在。11.如权利要求10所述的系统，其中编码所述CRISPR相关转座酶的所述多核苷酸包含与选自由SEQIDNO:1-123、604-627和2020-3379组成的组的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。12.如权利要求10-11中任一项所述的系统，其中所述靶标核酸序列包含编码核酸序列、非编码核酸序列、或编码核酸序列和非编码核酸序列的组合。13.如权利要求10-12中任一项所述的系统，其中所述靶标核酸序列包含内源性基因或转基因。14.如权利要求10-13中任一项所述的系统，其中所述系统包含二价阳离子。15.如权利要求10-14中任一项所述的系统，其中(a)所述引导RNA或编码所述引导RNA的DNA分子提供在第一核酸分子上，并且编码所述CRISPR相关转座酶的所述多核苷酸提供在第二核酸分子上，或(b)所述引导RNA或编码引导RNA的DNA分子和编码所述CRISPR相关转座酶的所述多核苷酸提供在单一核酸分子上。16.如权利要求10所述的系统，其中所述引导RNA呈经分离的RNA的形式，或在载体中编码，并且其中所述载体是病毒载体、质粒载体或土壤杆菌属载体。17.如权利要求10-16中任一项所述的系统，其进一步包含供体多核苷酸。18.如权利要求17所述的系统，其中所述供体多核苷酸包含编码核酸序列、非编码核酸序列、或编码核酸序列和非编码核酸序列的组合。19.如权利要求17所述的系统，其中所述供体多核苷酸包含启动子。20.如权利要求17所述的系统，其中所述供体多核苷酸包含一个或多个转基因。21.如权利要求10-20中任一项...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·M·奇拓尔，E·纳吉，
申请(专利权)人：孟山都技术公司，
类型：发明
国别省市：美国,US