带中性电荷的细胞穿透肽及作为细胞内运送载体的用途制造技术

一类带中性电荷细胞穿透肽，在生理条件下净电荷为0，并提供具体的氨基酸序列。并提供中性电荷细胞穿透肽作为细胞内运送载体的用途以及带中性电荷细胞穿透肽作为治疗药物在细胞内的运送载体的医药用途及作为造影剂在细胞内的运送载体的医学成像技术的用途。此外，中性电荷细胞穿透肽的同源物也具有细胞穿透的性能，可以作为细胞内运送载体及作为治疗药物在细胞内的运送载体的医药用途。

Cell penetrating peptides with neutral charges and their use as carriers for intracellular transport

A class of neutrally charged cell-penetrating peptides with a net charge of 0 under physiological conditions and specific amino acid sequences are provided. It also provides the use of neutral charge cell-penetrating peptide as intracellular delivery vector, the medical use of neutral charge cell-penetrating peptide as intracellular delivery carrier of therapeutic drugs and the use of medical imaging technology as intracellular delivery carrier of contrast agent. In addition, the homologues of neutral charge cell-penetrating peptides also have cell-penetrating properties, and can be used as intracellular delivery vectors and drug delivery vectors in cells.

【技术实现步骤摘要】
带中性电荷的细胞穿透肽及作为细胞内运送载体的用途
本专利技术涉及生物医药领域，特别涉及一类带中性电荷的细胞穿透肽及其作为哺乳动物细胞内运送载体在生物学和医药领域的应用。技术背景细胞膜是细胞与细胞外环境间的半透性屏障，具有选择性通透作用从而使细胞保持恒定的内环境。虽然这种磷脂双分子层对于细胞的存活和功能必不可少，它却给细胞内外货物分子的交换提出了挑战。由于蛋白、多肽、核苷酸等药物大分子物质和显影剂必须要达到细胞内部才能发挥相应的作用，因此实现这些物质的跨膜转运变得非常必要。目前，能够向细胞内转运大分子的技术主要有电穿孔(electroporation)、显微注射(microinjection)、脂质体转染(transfection)和病毒载体(viralvector)等，但这些技术由于效率低下、安全性差等原因，难以应用于临床诊断和治疗药物的研发。近年来，有关细胞穿透肽(cell-penetrationpeptides，CPPs)的研究为解决上述问题提供了一个良好的机遇。关于CPPs的首次报道出现在1988年，Frankel等发现来源于人免疫缺陷病毒HIV-1转录激活因子的蛋白Tat具有穿透细胞膜和核膜，并锚定于特异基因调控区的能力(Cell,1988,55:1189-1193)。随后研究还发现，Tat蛋白中的一段长度为11个氨基酸残基的碱性氨基酸序列YGRKKRRQRRR发挥了蛋白转运的作用(JBiolChem,1997,272:16010-16017)。经过二三十年的探索，人们逐渐认识到，CPPs是一类长约9～16个氨基酸的小分子多肽，富含碱性氨基酸。作为一种有效的运输载体，CPPs在体内外可以将多肽、蛋白、核酸、肽核酸、脂质体、显像剂、纳米大小颗粒等多种物质有效地运送入细胞，适用于几乎所有的真核细胞，并且具有蛋白转导发生迅速、操作简单，毒性、副作用较小等优点。由于CPPs的发现为细胞膜的结构和功能提供了极佳的研究工具，因而对于其穿膜机制的研究也得到了大量的关注。以研究最多的Tat为例，目前普遍认为，CPPs穿透细胞膜的过程基本上可分为两个阶段：首先通过电荷作用与细胞表面结合；然后穿透细胞膜进入细胞，释放进入胞浆乃至胞核。在第一阶段中，Tat能通过精氨酸残基的胍基与细胞表面上带有阴离子的胺聚糖、膜磷脂头部等发生强烈的相互作用，从而在细胞膜表面聚集。因此，氨基酸序列中含有较多的正电荷是目前穿透肽的主要序列特征之一。肝素(Heparin)是硫酸肝素蛋白多糖(heparansulfateproteoglycan,HSPG)上硫酸肝素(heparinsulfate,HS)的结构类似物，当与HS同时存在时，起到竞争性与配体结合的作用，而肝素酶Ⅲ(HeparinaseIII)可以特异性降解细胞膜表面的HS链，这两种抑制剂通过不同的机制都可以阻断细胞膜上HSPG的HS链与配体的相互作用，进而阻断正电荷CPPs的内化过程。在第二阶段中，CPPs内化的机制主要涉及三条途径(CellMolLifeSci.2005,62:1839-1849)：一是CPPs通过细胞脂质双分子层直接进入细胞内；二是CPPs在细胞表面形成特定的跨膜结构实现转运，比如微团模式，打孔模式等；三是内吞介导的内化模式，其中又可能涉及网格蛋白、胞膜窖和巨胞饮介导等具体内吞方式。上述三种途径中，内吞介导的内化模式目前被认为是大多数CPPs进入细胞的主要途径，也是研究最深入的一条途径。但是对于某一条CPPs(例如研究最为透彻的Tat)的穿膜途径而言，由于实验方法和条件的不一致，不同的研究机构和组织往往得到了不同的结论。另外，有研究发现，CPPs乃至货物分子的长度、电荷等都会对其具体的穿膜机制产生影响。由于上述因素的存在，加之研究手段的落后和实验条件的差异，使得对于CPPs的穿膜机制这一问题尚未取得统一的认识。另一方面，关于CPPs内吞进入细胞后的运输问题逐渐得到越多越多的关注和研究。有数据显示，目前已知的以正电荷为主的CPPs中，有相当数量的成员内化后会被包裹在内体中，直接导致其携带的药物分子无法得到有效的释放。该现象随着货物分子量的增加而更为明显。有学者提出CPPs转运药物的限速步骤就在于其逃离胞吞囊泡的过程(NatMed,2004,10(3):310-315)。他们发现，大多数的Tat(48-57)-Cre通过脂筏发生胞吞后，可滞留在胞吞中长达24小时，同时这一逃离过程的效率是非常低下的。尽管目前对于CPPs如何作用于细胞脂膜，穿透脂膜的机理目前尚不完全清楚，细胞内药物转运释放效率尚不尽如人意，但其在生物和医药领域的诱人应用前景却是毋庸置疑的。由于CPPs能够显著提高货物分子的通透性，因而能够携带显影剂和放射性同位素标记的抗体分子穿透如血脑屏障等特殊生理结构，达到细胞的内部，从而为中枢系统疾病部位的可视化提供了途径。S.Santra等用微导管将和Tat共轭结合的量子点通过颈动脉导入大鼠体内(Chem.Commun.(Camb.),2005,144-3146)后，发现Tat能够成功和迅速地将量子点运送到脑部实质，通过手持式的紫外灯照射就能够达到脑部组织的荧光可视化，而无需破坏血脑屏障的完整结构。此外，在肿瘤治疗方面，CPPs也成为了重要的工具，用于运输化疗药物和促凋亡蛋白至肿瘤细胞内部。为了达到靶向性治疗的目的，研究者设计将Tat与抗Her-2/neu的模拟肽AHNP相连接(CancerRes.2006,66:3764-3772.)。该模拟肽能够特异性与表皮生长因子受体ErB2相结合，而在30％的乳腺癌患者中受体ErB2都出现过表达。经过改造后，癌细胞特异性药物转运体系能够大大提高肿瘤细胞内部药物的浓度，从而达到改善肿瘤治疗效果的目的。综上所述，目前已知的CPPs分子序列中大都含有较多的碱性氨基酸(如精氨酸和赖氨酸)，其内化强烈依赖于生理条件下带正电荷的碱性氨基酸与细胞膜外带负电硫酸肝素的相互作用，同时多数内化后会被限制在内吞囊泡中，胞内释放过程效率低下。考虑到对于经典的CPPs而言，序列中的正电荷为其发生内化所必须具备的条件，带有中性电荷CPPs可能代表着一类尚未被人们所认识的新家族，并可能成为大分子研究工具和治疗药物的转运载体在细胞生物学和医药领域得到应用。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一类新的带有中性电荷的细胞穿透肽序列及其同源物、类似物和衍生物，以及该类穿透肽作为大分子研究工具和治疗药物的转运载体在细胞生物学和医药领域的应用。本专利技术的上述目的通过如下技术手段实现：提供一种带中性电荷细胞穿透肽，在生理条件下净电荷为0。上述带中性电荷的细胞穿透肽，氨基酸序列为：PNEKRDH、NEKRDHM、HGENNRY、RDHTTPN、QMSKQHE、DPKASQQ、QERASQG、THERMHY、TATKNND、SNHQYSS、WPPPTQQ、DTPRGAH、TWKEHPM、NYNSHNV、WHAPSHH、PAHGTQQ、QSNQHTV、RTSDSHF、HDGRLPW、TTSHNMH、SSTYPHY、GNPSLNQ、HHFSAQH、NHYLSTQ、ANHGVRE、WPNSTST、QDSRFHV、HGVWSQQ、NWYQSLT、PTLHSSQ、EAH本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.带中性电荷细胞穿透肽，其特征在于：在生理条件下净电荷为0。

【技术特征摘要】
1.带中性电荷细胞穿透肽，其特征在于：在生理条件下净电荷为0。2.根据权利要求1所述的带中性电荷的细胞穿透肽，其特征在于：氨基酸序列为，PNEKRDH、NEKRDHM、HGENNRY、RDHTTPN、QMSKQHE、DPKASQQ、QERASQG、THERMHY、TATKNND、SNHQYSS、WPPPTQQ、DTPRGAH、TWKEHPM、NYNSHNV、WHAPSHH、PAHGTQQ、QSNQHTV、RTSDSHF、HDGRLPW、TTSHNMH、SSTYPHY、GNPSLNQ、HHFSAQH、NHYLSTQ、ANHGVRE、WPNSTST、QDSRFHV、HGVWSQQ、NWYQSLT、PTLHSSQ、EAHKTLS、SSTKDSV、QPTTSYF、TAASHWN、TTTTSNA、AREPCLN、HSGVPHG、HNVSGGS、HPETLVK、NTPYLTS、DATYGKL、GQGVWPY、ERAGGLL、NSHNVYI、HAPPSSL、DAVRLHW、PILPHGQ、HGAGTAS、APLGTPH、VHNQLQL、PYSSAAS、GPGTSFG、STQSALS、NPGLSSF、STSTAMW、AINGHAS、VPTPSAS、NLGSSYL、WSVSLYH、TSMPLST、PVPWPTL、TLTPTSC、PSLANPL、LPSFIHQ、TTYGAGV、LDGV...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜勇，刘芸，罗海华，
申请(专利权)人：南方医科大学，
类型：发明
国别省市：广东,44