一种利用温度响应型水凝胶包裹递送外泌体并增强其治疗效果的技术手段制造技术

本发明专利技术是一种利用温度响应型水凝胶包裹递送外泌体并增强其在组织损伤中的治疗效果的技术手段。该方法是使用温度响应型水凝胶在4℃为液体时，将干细胞来源的外泌体包裹，在注射至损伤部位后在体内形成包裹了外泌体的水凝胶，并将外泌体缓慢释放至损伤组织；所述水凝胶可以增强外泌体在损伤部位的保留率和局部浓度，同时提高外泌体内功能分子的稳定性，并可以将外泌体缓释到损伤部位，进一步提高外泌体的治疗效果，并促进损伤组织结构和功能的恢复。

A technical means of delivering exocrine body with temperature responsive hydrogel package and enhancing its therapeutic effect.

The invention relates to a technical means of using temperature-responsive hydrogel to wrap and deliver exosomes and enhance the therapeutic effect in tissue injury. The method uses a temperature-responsive hydrogel to encapsulate the stem cell-derived exosome when it is liquid at 4 C, forms a hydrogel encapsulating the exosome in vivo after injection to the injured site, and releases the exosome slowly to the injured tissue; the hydrogel can enhance the retention rate and local concentration of the exosome at the injured site. At the same time, it can improve the stability of functional molecules in the exosome and slow release the exosome to the injured site, further improve the therapeutic effect of the exosome, and promote the recovery of the injured tissue structure and function.

【技术实现步骤摘要】
一种利用温度响应型水凝胶包裹递送外泌体并增强其治疗效果的技术手段
本专利技术涉及利用温度响应型水凝胶包裹递送外泌体并增强其在组织损伤中的治疗效果的技术手段，属于组织工程与新医药

技术介绍
外泌体是细胞旁分泌成分的主要形式，在细胞间通讯中起着十分重要的作用。外泌体通常被认为是由细胞内部多囊泡体向内出芽所产生的微囊泡，在多囊泡体与细胞膜融合时，将其内部的微囊泡释放至细胞膜外，形成外泌体。外泌体的直径约为30-100nm，由于其特殊的形成方式，外泌体内部富含细胞内具有生物活性的信号分子，包括DNA、RNA、microRNA及蛋白质等。外泌体介导的细胞间通讯可以为临近细胞提供大量的生物活性材料及信号分子，这项功能不能被简单的可溶性旁分泌因子所取代，可以为细胞内蛋白质及遗传物质的水平转移提供有效的途径。外泌体在正常的生理过程中扮演着重要的角色，如炎症反应、凝血机制及内环境的稳态维持；同时外泌体在病理过程中也具有很大的影响，尤其是在自身免疫疾病和肿瘤中。因此，病理性的外泌体作为疾病诊断的生物标志和以外泌体作为疾病的新治疗方法成为了全新的研究领域。水凝胶作为一种亲水聚合物的交联形式，已经展现出是一种在生物及医学领域具有巨大潜力的生物材料。这些亲水聚合物网络中通常对水有很高的亲和力，但由于其通过物理或化学作用形成了交联网络，故不会溶解在水中，同时水可以渗入聚合物的聚合物网络之间，随后引起膨胀形成一种水凝胶模式。根据水凝胶对外界环境的响应，可以将水凝胶分为光响应型水凝胶、pH响应型水凝胶和温度响应型水凝胶。其中，温度响应型水凝胶是目前研究最广泛的响应型水凝胶系统，温度在4℃时为液态，在处于37℃时，发生交联反应形成水凝胶，具有良好的可注射性。可注射的温敏型聚合物溶液在不加任何有机溶剂和交联剂的情况下，经很小的插管导入体内后可原位形成（半）固体凝胶，即在体温时发生溶胶－凝胶转变。作为植入体，可经过简单的混合而负载多种治疗药物和不需预设支架形状，是理想的药物载体、栓塞材料和组织工程支架材料。此外，水凝胶作为一种天然大分子化合物，具有一定的机械强度和可降解性等物理参数，同时也具有生物相容性和提供生物相关微环境的生物学特性，在医学领域具有广泛的应用。此外，因温度响应型水凝胶具有良好的可注射性，可以避免置放已成形细胞支架带来的损伤，故温度响应型水凝胶可作为组织工程的细胞支架用于移植细胞。天然水凝胶具有疏松多孔的网状结构，可以模拟天然的细胞外基质并为细胞粘附、迁移和增殖提供支持；另外，天然水凝胶可以被溶酶体降解，在生物体内具有良好的生物可降解性，可以完全被生物降解，以便在组织修复后完全被生物组分取代。因此，以温度响应型水凝胶为基础的多种类型的细胞支架材料已经在组织工程领域显示出重要的应用价值。近年来，科学家们发现外泌体作为细胞外囊泡的重要组成部分，不是用于细胞内垃圾物质的排放，而是细胞间通讯的重要形式。外泌体通常被认为是由细胞内部多囊泡体向内出芽所产生的微囊泡，在多囊泡体与细胞膜融合时，将其内部的微囊泡释放至细胞膜外，形成外泌体。外泌体的直径约30-100nm，由于其特殊的形成方式，外泌体内部富含细胞内具有生物活性的信号分子，包括DNA、RNA、microRNA及蛋白质等。被释放至细胞外的外泌体可以通过不同的途径进入靶细胞内，发挥其生物学功能。第一，与细胞分泌的可溶性旁分泌因子类似，外泌体可以通过与靶细胞膜表面受体结合，触发靶细胞内的信号转导通路，并进一步调节靶细胞内的生物学过程；第二，外泌体可以被靶细胞内在化，这一过程依赖于网格蛋白介导的内吞作用、脂筏介导的内吞作用及胞饮作用等；第三，外泌体可以通过与靶细胞膜融合，直接将外泌体内携带的活性物质递送到靶细胞内。外泌体介导的细胞间通讯可以为邻近细胞提供大量的生物活性材料及信号分子，这项功能不能被简单的可溶性旁分泌因子所取代，可以为细胞内蛋白质及遗传物质的水平转移提供有效的转移途径。随着细胞生物学和医学前沿交叉领域的不断发展，外泌体的研究逐渐深入，越来越多的外泌体在疾病治疗中展现出令人振奋的治疗效果。如间充质干细胞来源的外泌体通常被认为具有与间充质干细胞相似的功能，包括促进组织损伤修复、抑制炎症反应及减轻组织纤维化程度等。但是，在实际应用过程中，由于外泌体直径较小，易于被免疫系统及网状内皮系统吞噬，在注射后外泌体在损伤部位的滞留率很低；同时，虽然在低温保存时，外泌体内的成分十分稳定，但是外泌体被注射至体内后其内部携带的生物活性分子的稳定性目前还不清楚。近年来，生物材料被广泛应用于干细胞治疗与组织工程领域，其中温度响应型水凝胶作为一种水溶性高分子，具有疏松多孔的网状结构，同时其可以对温度进行响应，具有可注射性，并且具有良好的生物相容性、生物可降解性和一定的分子识别能力。利用温度响应型水凝胶包裹并缓释外泌体，理论上可以提高外泌体在机体环境中的稳定性，并且可以提高外泌体在损伤部位的滞留率，并且可以为组织损伤修复提供良好的微环境。
技术实现思路
本专利技术是一种利用温度响应型水凝胶包裹递送外泌体并增强其在组织损伤中的治疗效果的技术手段。该专利技术是使用温度响应型水凝胶在4℃为液体时，将干细胞来源的外泌体包裹，在注射至损伤部位后在体内形成包裹了外泌体的水凝胶，并将外泌体缓慢释放至损伤组织。所述水凝胶为温度响应型，是一类以溶液状态给药后在用药部位立即发生相转变，由液体固化形成半固体凝胶的制剂。可以是壳聚糖水凝胶，但不限于壳聚糖水凝胶，还包括以胶原纤维、聚乙二醇等为原料的温度响应型水凝胶。所述外泌体为干细胞来源的外泌体，所述干细胞包括脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、尿液来源干细胞、内皮祖细胞、或心脏干细胞等。本专利技术可以有效增强外泌体在损伤部位的滞留率，同时提高外泌体内蛋白质及microRNA等有效成分的稳定性，并可以将外泌体缓释到损伤部位，进一步提高外泌体的治疗效果，促进损伤组织结构和功能的恢复。所述组织损伤包括下肢缺血、肾脏损伤、心肌梗死及皮肤损伤等。附图说明图1A为温度响应型水凝胶在4℃和37℃的状态；图1BCD为外泌体特征的鉴定，该外泌体为间充质干细胞分泌的外泌体。图2为水凝胶包裹的外泌体在下肢缺血小鼠损伤部位的滞留情况，与未被包裹的外泌体相比，温度响应型水凝胶可以有效提高外泌体在损伤部位的滞留率。图3AB为水凝胶包裹的外泌体内蛋白质在37℃的稳定性；图C为水凝胶包裹的外泌体内microRNA在37℃的稳定性，温度响应型水凝胶可以有效增强外泌体内功能分子在37℃的稳定性。图4为水凝胶包裹的外泌体的缓释效率，R2=0.8672。图5为水凝胶包裹缓释的外泌体可以更好的促进下肢缺血组织结构和功能的恢复。H&E染色及Masson染色显示水凝胶包裹的外泌体治疗组中缺血肌肉纤维化最轻，结构恢复最好。具体实施方案下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可以从商业途径获得。实施例1，本专利技术提供一种干细胞来源的外泌体提取及鉴定的方法。细胞培养基、双抗、胰酶等试剂均购于Gibco公司；细胞培养耗材均购于Corning公司。细胞培养所需血清为去除外泌体的胎牛血清，购于BI公司，处理步骤如下：将胎牛血清置于超速离心管中，120000g在4℃离心2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种温度响应型水凝胶，可以是壳聚糖水凝胶，但不限于壳聚糖水凝胶，还包括以胶原纤维、聚乙二醇等为原料的温度响应型水凝胶。

【技术特征摘要】
1.一种温度响应型水凝胶，可以是壳聚糖水凝胶，但不限于壳聚糖水凝胶，还包括以胶原纤维、聚乙二醇等为原料的温度响应型水凝胶。2.根据权力要求1所述的水凝胶，其特征在于：所述水凝胶为温度响应型水凝胶，是一种仅随贮藏条件和用药部位的温度变化而发生相转变的原位凝胶。该水凝胶溶液在4℃时为液态，处于37℃时交联形成疏松多空的网络状结构。3.该治疗手段的有效成分为干细胞来源的外泌体，一种从体外培养的离体细胞体外培养基中分离提取，携带了来源细胞内蛋白质、RNA及DNA等生物活性分子，并具有治疗功能的细胞旁分泌成分。4.根据权力要求3所述的外泌体，其特征在于：该外泌体来源于干细胞，...

【专利技术属性】
技术研发人员：李宗金，张凯悦，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：天津,12