重组巴曲酶混合组合物及包含所述重组巴曲酶混合组合物的止血粉末或止血垫制造技术

本发明专利技术涉及新的重组巴曲酶混合物及包含该重组巴曲酶混合物的止血用组合物及其制造方法。根据本发明专利技术，本发明专利技术的止血用组合物抑制再出血而止血效果优良，有即使以固体形态制造也维持活性，适用于局部止血剂而能容易利用的优点。

Recombinant batroxobin mixture composition and hemostatic powder or pad containing the recombinant batroxobin mixture composition

The invention relates to a new recombinant batroxobin mixture and a hemostatic composition comprising the recombinant batroxobin mixture and a manufacturing method thereof. According to the present invention, the hemostatic composition of the present invention has excellent hemostatic effect by inhibiting rebleeding, maintains activity even when manufactured in solid form, and is suitable for local hemostatic agents and can be easily used.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】重组巴曲酶混合组合物及包含所述重组巴曲酶混合组合物的止血粉末或止血垫
本专利申请要求2015年12月14日向韩国特许厅提出的韩国专利申请第10-2015-0177952号的优先权，所述专利申请的公开事项通过引用并入到本说明书中。本专利技术涉及在酸性条件下也维持止血活性的重组巴曲酶混合组合物及包含该重组巴曲酶混合组合物的止血垫。
技术介绍
蛇毒对包含人的哺乳类的血液凝固系统及血栓溶解系统的影响早有研究，多种有效成分被分离，其活性也被弄清。已知构成蛇毒的诸种成分直接间接影响纤维蛋白凝固(fibrinclotting)或血小板凝集等而具有作为凝固促进剂(pro-coagulant)或抗凝固剂(anticoagulant)的功能(Meaume，J.Toxicon，4:2558(1966)；Matsuietal.，Biochim.Biophys.Acta.，1477：146-156(2000))。在这些中，一部分成分已在血栓症的诊断及治疗中广泛使用。其中，切断纤维蛋白-肽而将纤维蛋白原转换为纤维蛋白的凝血酶类似酶(thrombin-likeenzyme)至今已被报告20余种以上报告，一部分甚至都弄清了cDNA序列。凝血酶类似酶的作用与作为哺乳类本来的血液凝固蛋白的凝血酶不同，在初期水解纤维蛋白原分子的纤维蛋白肽A而形成被称为des-A-纤维蛋白的不稳定的纤维蛋白凝块(fibrinclot)，但随着时间的经过，该不稳定的纤维蛋白凝块因活体内的血栓溶解系统(fibrinolysissystem)的运行而被快速分解，结果减小血中的纤维蛋白原浓度(Pirkle，H.，andStocker，K.Thromb.Haemost.65:444-450(1991)；Marsh，N.A.，BloodCoagul.Fibrinolysis，5:339-410(1994))。在实际临床中，利用这样的两面性的酶特性而既作为止血剂使用，也作为血栓的预防及治疗剂应用。另外，此酶有不仅不影响血液中的其他凝固因子，还不影响血小板的活化的优点，在手术1～2小时前少量(2NIHunit/60kg)肌肉及静脉注射就呈现有效的止血活性。相反，通过调节酶的施用量和施用时间而能无会在使用血栓溶解酶时出现的如出血这样的副作用地降低血中纤维蛋白原浓度，在该过程中，因形成的des-A-纤维蛋白和FDP(fibrinogendegradationproducts，纤维蛋白原降解产物)的释放，刺激血管内皮细胞而诱导纤溶酶原活化剂的生成，抑制凝血酶的活性而还在血栓症的预防和治疗中使用(Schumacheretal.，Thromb.Res.81:187-194(1996)；及BellW.R.Jr.，Drugs，54:18-30(1997))。最近有报告称，利用这样的凝血酶类似酶的纤维蛋白原减小效果而对于因肝素施用而发生的肝素诱导性血小板减小症(heparin-inducedthrombocytopenia)或急性缺血性中风(acuteischemicstroke)的治疗(Dempfleetal.Blood，96，27932802，2000)也有效果。在临床上实际使用的凝血酶类似酶均为从蛇毒分离纯化的天然型的蛋白，最具代表性的是从作为中南美毒蛇的Bothropsatroxmoojeni的毒分离的巴曲酶。在瑞士Pentapharm公司垄断销售，也作为reptilase(止血用)，defibrase(血栓溶解用)，reptilase-reagent(诊断试剂用)等的商品名在市售。另外，从作为中南美毒蛇的Bothropsjararaca的毒纯化的botropase(止血用，意大利Ravizza公司)，从Malayanpitviper和Calloselasmarhodostoma的毒分离的ancrod(美国KnollPharmacetical公司)等也在售。另外，最近，作为在手术时的出血防止及缝合目的的自身纤维蛋白密封剂(autologousfibrinsealant)，利用巴曲酶的VivostatSystem(丹麦，Vivosolution公司)等受到青睐。但是，天然型巴曲酶从活的蛇毒提取，纯化，有难以除去蛇毒中既有的其他毒成分的污染，且不容易按需供给的缺点。另外，因外部环境而蛇毒成分的变化大，纯化标准化难。如此，从蛇纯化提取的天然型巴曲酶由于存在大量生产的局限，多个研究团队对重组蛋白生产方法进行了研究。在如大肠杆菌一样的微生物中表达真核生物来源的蛋白时，在真核生物来源基因的转录后翻译过程中发生因作为原核细胞的大肠杆菌的翻译效率低的基因密码子而蛋白表达低的现象，为了解决这个问题，利用具有可在大肠杆菌中识别低频度的氨基酸密码的外来真核生物的tRNA基因的重组大肠杆菌菌株而提高蛋白的翻译的方法等被商品化。即便如此，出现在大肠杆菌表达时在蛋白的再折叠过程中被制成非活性的蛋白的现象(参照：Yangetal.，Biotechnol.Lett.，25:101-104(2003)；Fanetal.，Biochem.Mol.Biol.Int.47:217-225(1999)；Maedaetal.，J.Biochem.，109:632-637(1991))。从而，本专利技术人开发了制造表达收率高，比天然型酶活性优秀的重组巴曲酶的方法，这详细记载在WO2009/084841中。但是，根据至今的报告，尚无分离适用于止血垫而呈现出优秀的活性，或呈现出再出血(rebleeding)减少效果的重组巴曲酶混合组合物的例子。在本说明书通篇引用了多个的论文及专利文献，并表示出了该引用。引用的论文及专利文献的公开内容通过引用整体并入本说明书中，从而本专利技术所属的
的水平及本专利技术的内容能够被更加明确地说明。【专利技术详述】【技术问题】本专利技术人为了能使重组巴曲酶也容易地适用于局部出血而进行了锐意的研究努力。其结果确认，本专利技术的重组巴曲酶混合物在酸性条件下也维持活性，在适用于止血垫时也呈现优秀的活性，能抑制再出血(rebleeding)，从而完成本专利技术。从而，本专利技术的旨在提供重组巴曲酶混合组合物。本专利技术的还旨在提供包含本专利技术的重组巴曲酶混合组合物的止血用组合物。本专利技术的其他目的及优点能从下述的专利技术详述，权利要求书及图更加明晰。【技术问题的解决手段】根据本专利技术的一实施方式，本专利技术提供包含至少2种以上的以下通式1所示的糖基化(glycosylation)的重组巴曲酶的重组巴曲酶混合组合物：【通式1】Ma-Gb-B，在所述通式1中，所述M表示甘露糖，所述G表示N-乙酰葡萄糖胺，所述B表示重组巴曲酶，所述a表示11～13的整数，所述b表示1～3的整数，所述Ma是直链或支链型甘露糖寡聚体，所述Gb是单一N-乙酰葡萄糖胺或直链型N-乙酰葡萄糖胺寡聚体，所述Ma及Gb键合形成糖基化结构体(glycosylationstructure)，所述糖基化结构体键合于所述重组巴曲酶。本专利技术人为了能使巴曲酶也容易地适用于局部出血而进行了锐意的研究努力。其结果确认，本专利技术的巴曲酶混合组合物在酸性条件下也维持活性，在适用于止血垫时也呈现优秀的活性，能抑制再出血(rebleeding)。在本说明书中使用的术语“重组巴曲酶”表示对天然本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.重组巴曲酶混合组合物，其包含至少2种以上的下示通式1所示的糖基化(glycosylation)的重组巴曲酶：【通式1】Ma‑Gb‑B，在所述通式1中，所述M表示甘露糖，所述G表示N‑乙酰葡萄糖胺，所述B表示重组巴曲酶，所述a表示11～13的整数，所述b表示1～3的整数，所述Ma是直链或支链型甘露糖寡聚体，所述Gb是单一N‑乙酰葡萄糖胺或直链型N‑乙酰葡萄糖胺寡聚体，所述Ma及Gb键合形成糖基化结构体(glycosylation structure)，所述糖基化结构体键合于所述重组巴曲酶。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.12.14 KR 10-2015-01779521.重组巴曲酶混合组合物，其包含至少2种以上的下示通式1所示的糖基化(glycosylation)的重组巴曲酶：【通式1】Ma-Gb-B，在所述通式1中，所述M表示甘露糖，所述G表示N-乙酰葡萄糖胺，所述B表示重组巴曲酶，所述a表示11～13的整数，所述b表示1～3的整数，所述Ma是直链或支链型甘露糖寡聚体，所述Gb是单一N-乙酰葡萄糖胺或直链型N-乙酰葡萄糖胺寡聚体，所述Ma及Gb键合形成糖基化结构体(glycosylationstructure)，所述糖基化结构体键合于所述重组巴曲酶。2.权利要求1的重组巴曲酶混合组合物，其特征在于，所述b是2。3.权利要求1的重组巴曲酶混合组合物，其特征在于，所述重组巴曲酶包含SEQIDNO:1的氨基酸序列。4.权利要求1的重组巴曲酶混合组合物，其特征在于，2种以上的重组巴曲酶各自具有不同的a值。5.权利要求1的重组巴曲酶混合组合物，其特征在于，所述重组巴曲酶混合物包含a值各自是11、12或13的3种重组巴曲酶。6.权利要求1的重组巴曲酶混合组合物，其特征在于，所述糖基化结构体键合于SEQIDNO:1的第146个及第225个氨基酸残基的N-末端。7.权利要求1的重组巴曲酶混合组合物，其特征在于，包含在所述重组巴曲酶混合物中的重组巴曲酶分子的平均分子量是28～31kDa。8.权利要求1的重组巴曲酶混合组合物，其特征在于，当所述a是11时，所述糖基化结构体(glycosylationstructure)具有下示通式2所示的结构：【通式2】在所述通式2中，所述M是甘露糖，所述G是N-乙酰葡萄糖胺。9.权利要求1的重组巴曲酶混合组合物，其特征在于，当所述a是12时，所述糖基化结构体(glyco...

【专利技术属性】
技术研发人员：金钟卓，西门荣，金晋佑，姜相宇，禹龙济，高银惠，
申请(专利权)人：NCBIT有限公司，
类型：发明
国别省市：韩国,KR