本发明专利技术公开了检测肺癌脑转移的miRNA组合及含有该组合的试剂盒，所述miRNA组合包括miR‑10b‑3p、miR‑200c‑3p、miR‑145‑5p。所述试剂盒包括上述miRNA组合的正反向引物、外参U6 RNA的正反向引物、脑脊液RNA提取系统、逆转录试剂、PCR扩增试剂、cDNA混合阴对照品和cDNA混合阳对照品。本发明专利技术采用一组miRNA作为新的肺癌脑转移标记物，将改进单一的标记物所难以克服诊断低效能包括灵敏度和特异度等；也可避免单项检测及传统检测方法出现的漏检误判。本发明专利技术提供了采用上述miRNA组合用于肺癌预后脑转移情况辅助筛查试剂盒，不仅检测方便，且定量精确，大大提高疾病检测的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以对临床肺癌脑转移风险评估有辅助作用。
【技术实现步骤摘要】
检测肺癌脑转移的miRNA组合及含有该组合的试剂盒
本专利技术属于医学分子生物学
，具体涉及检测肺癌脑转移的miRNA组合及含有该组合的试剂盒。
技术介绍
近年来，随着肺癌发病率上升，诊疗技术不断发展，使患者生存期延长，肺癌脑转移的发生和诊断率也逐年升高。肺癌脑转移发生率明显高于黑色素瘤、乳腺癌、肾癌及结直肠癌，20%-65%的肺癌患者在病程中会发生脑转移，是脑转移性肿瘤中最常见的类型，其中肺腺癌发生脑转移的几率更高，占颅内转移瘤的40％-70％，隐匿性极强，其早期症状大都不明显，首发症状复杂多样，可分为两种：一种是肺癌诊断治疗后一段时间发现颅内转移；另一种先出现颅内转移，而胸部无症状。通过病理学确诊时已错过最佳治疗时间窗，影响患者的预后，导致患者生存时间显著缩短。计算机断层扫描（CT）、磁共振成像（MRI）等影像学技术进行诊断也难以发现脑转移早期微小病灶，且患者受经济条件制约等因素未能接受连续的影像学检查。另有研究指出，肺癌脑转移的误诊率可高达30％-50％。首先脑血管疾病发病率远高于肿瘤脑转移，有高血压、动脉硬化的患者，肿瘤脑转移往往被忽视；其次肺癌原发灶较小或者为周围型肺癌，往往不出现呼吸系统症状，以脑转移为首发症状的肺癌，其临床表现多与脑原发性肿瘤脑血管病及脑脓肿等病相似；最后颅内转移瘤影像学的表现也多样化。。另外，由于血脑屏障的存在，致使化疗对脑转移的作用有限，恶性程度高，发展迅速。脑转移风险也随着生存的提高而上升。研究显示：局部晚期肺癌患者的生存和脑转移率呈正相关，脑转移对肺癌患者生存的危害逐渐上升。因此，随着局部和颅外远处控制的改善，对早期的肺癌患者，脑转移的早期筛查和预警至关重要。近年来，美国国家临床生化研究院临床实验应用指南也指出应针对不同肺癌病理类型选择相应的蛋白联合抗体标记物组合；欧洲放射学会，呼吸学会也推荐7种自身抗体联合检测早期肺癌。中国肺癌脑转移诊治专家共识（2017年版）指出：腰椎穿刺及脑脊液检查脑脊液压力及细胞学检查癌细胞，或利用血清肿瘤标记物来检查抗原抗体都可作为辅助检查手段。临床资料也证实，单靠某一种标志物去诊断疾病，影响因素太多，不如联合诊断的价值大。此外，随着RNA作为肿瘤标志物的出现，提示在肿瘤发生发展过程中，RNA比受体、蛋白等出现得更早；最后，就肿瘤脑转移而言，由于血浆/血清中的RNA表达来源不明，采用血清或者血浆不能进行准确判断，而这对寻找有效的预测恶性肿瘤脑转移的标志物尤为重要。微小RNA（miRNA）是一种小核RNA，长约22个核苷酸，不编码蛋白质，但可以与mRNA结合并在基因调控中起重要作用。大量研究表明miRNA在肿瘤中起着促癌基因或抑癌基因的作用，在不同的恶性肿瘤中，同一条miRNA的作用可能不同。越来越多的证据支持实体肿瘤有特异的miRNA标记。单条miRNA可调控不同通路的靶基因，而单个基因也可被多个不同的miRNA调控，进而参与肿瘤的发生发展。MiRNA不仅在组织中，也在体液（血液，尿液，脑脊液）中稳定存在。脑脊液直接与中枢相连，参与脑和脊髓的物质代谢，中枢神经系统发生病变时，miRNA可从病变组织释放入脑脊液，因此脑脊液中存在大量以脑和脊髓组织为来源的miRNA，其表达改变能充分反映中枢的病变情况并且脑脊液中所含蛋白的模式比血液简单的多，miRNA检测的干扰因素相对较少，能更好筛选标志物，便于重复和统一。
技术实现思路
本专利技术是鉴于脑脊液中miRNA肿瘤标记物组合对肺癌脑转移的早期筛查可能大有帮助，专利技术人前期对肺癌脑转移进行了详细研究，在中国肺癌脑转移诊治专家共识（2017年版）的基础上，克服上述问题辅助检查手段的缺点的，提供一种制备方法简单、准确性高、适用性广，能够对肺癌病人是否脑转移情况进行风险评估的miRNA组合及试剂盒。为实现上述目的，本专利技术提供了检测肺癌脑转移的miRNA组合，包括miR-10b-3p、miR-200c-3p、miR-145-5p，所述miRNA分子的序列号、序列、表达趋势及外参基因见表3。用于检测肺癌脑转移的试剂盒，包括上述miR-10b-3p、miR-200c-3p、miR-145-5p的正反向引物、外参U6RNA的正反向引物、脑脊液RNA提取系统、逆转录试剂、PCR扩增试剂、cDNA混合阴性对照品和cDNA混合阳性对照品。优选的，所述miR-10b-3p、miR-200c-3p、miR-145-5p和外参U6RNA的正反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示（见表5）。优选的，本专利技术所述肺癌主要类型为肺腺癌。优选的，所述cDNA混合阴性对照品的制备方法为：将50例肺癌非脑转移患者及帕金森、癫痫、偏头痛、脊髓炎、痴呆、白血病患者的脑炎等非肿瘤性神经系统疾病患者脑脊液样本提取的总RNA混合后，逆转录并稀释，得到cDNA混合阴性对照品。优选的，所述cDNA混合阳性对照品的制备方法为：将50例肺腺癌脑转移患者脑脊液样本提取的总RNA混合后，逆转录并稀释，得cDNA混合阳性对照品。优选的，所述脑脊液RNA提取系统包括裂解液、HiBindRNA结合柱、RNAwashbufferI、RNAwashbufferII和收集管。优选的，所述逆转录试剂包括5×iScriptReactionMix、iScriptReverseTranscriptase和DEPCH2O。优选的，所述PCR扩增试剂包括5×FastStartUniversalSYBRGreenMaster(ROX)和DEPCH2O。上述试剂盒在使用时预测肺癌是否出现脑转移的miRNA表达情况分4类：（1）miR-10b-3p、miR-200c-3p均阳性表达，此时不必再检测miR-145-5p，说明患者出现脑转移；（2）miR-10b-3p阴性表达、miR-200c-3p阳性表达，此时检测miR-145-5p，当miR-145-5p阳性表达时说明患者出现脑转移；（3）miR-10b-3p阴性表达、miR-200c-3p阳性表达，此时检测miR-145-5p，当miR-145-5p阴性表达时说明患者可能出现脑转移，定期复查miR-10b-3p、miR-200c-3p的表达；（4）miR-10b-3p、miR-200c-3p和miR-145-5p均阴性表达，说明患者未出现脑转移，建议定期复查。优选的，本专利技术试剂盒中还含有其使用说明书。本专利技术的有益效果是：1.从脑脊液中筛选的一组在肺癌脑转移及对照组患者之间差异表达的miRNAs，筛选出的三条miRNA组合可有效评估肺癌患者癌细胞脑转移的增殖和侵袭能力，进一步指导临床治疗。2.采用一组miRNA作为新的肺癌脑转移标记物，将改进单一的标记物所难以克服诊断低效能包括灵敏度和特异度的等；也可避免单项检测及传统检测方法出现的漏检误判。3.联合检测可有效提高已诊断为肺癌的此类高危人群是否脑转移的检出率。4.用于肺癌预后脑转移情况辅助筛查的试剂盒的制作和操作流程是基于miRNA的荧光定量PCR技术。通过荧光定量PCR法检测miRNA的表达差异，再根据miRNA表达差异辅助评估肺癌预本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.检测肺癌脑转移的miRNA组合，其特征在于，包括miR‑10b‑3p、miR‑200c‑3p、miR‑145‑5p。
【技术特征摘要】
1.检测肺癌脑转移的miRNA组合，其特征在于，包括miR-10b-3p、miR-200c-3p、miR-145-5p。2.用于检测肺癌脑转移的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的miR-10b-3p、miR-200c-3p、miR-145-5p的正反向引物、外参U6RNA的正反向引物、脑脊液RNA提取系统、逆转录试剂、PCR扩增试剂、cDNA混合阴性对照品和cDNA混合阳性对照品。3.根据权利要求2所述用于检测肺癌脑转移的试剂盒，其特征在于，所述miR-10b-3p、miR-200c-3p、miR-145-5p和外参U6RNA的正反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示。4.根据权利要求2所述用于检测肺癌脑转移的试剂盒，其特征在于，所述cDNA混合阴性对照品的制备方法为：将肺癌非脑转移患者及非肿瘤性神经系统疾病脑脊液样本提取的总RNA混合后，逆转录并稀释，得到cDNA混合阴性对照品。5.根据权利要求2所述用于检测肺癌脑转移的试剂盒，其特征在于，所述cDNA混合阳性对照品的制备方法为：将肺腺癌脑转移患者脑脊液样本提取的总RNA混合后，逆转录并稀释，得cDNA混合阳性对照品。6.根据权利要求2所述用于检测肺癌脑转移的试剂盒，其特征在于，所述脑脊液RNA提取系统包...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐茜，赵珂，阚云超，姚伦广，李奥琦，李心茹，
申请(专利权)人：南阳师范学院，
类型：发明
国别省市：河南,41
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