一种适用于生物样本的SEM检测样品制备试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了适用于生物样本的SEM检测样品制备试剂盒及其应用，该试剂盒包括有多孔板，多孔板的孔内设置有多聚赖氨酸修饰的硅片，及处理样本的试剂等。将该试剂盒用于生物样本的SEM检测，主要有以下步骤：将生物样本溶液滴加在多孔板内的多聚赖氨酸修饰的硅片上；去除多余的生物样本溶液；然后用缓冲液孵育，再用磷钨酸处理后，并经含六甲基二硅氮烷的乙醇处理干燥，获得SEM检测样品，并进行SEM检测。该试剂盒可用于生物样本的SEM检测使用，具有实验结果重复性好，分析结果准确性高等优点。

A sample preparation kit for SEM detection of biological samples and its application

The invention discloses a sample preparation kit for SEM detection of biological samples and its application. The kit comprises a porous plate, a polylysine modified silicon wafer arranged in the pore of the porous plate, and a sample processing reagent, etc. The reagent kit is used for the detection of bio-samples by SEM. The main steps are as follows: dropping the bio-sample solution onto the polylysine modified silicon in the porous plate; removing the excess bio-sample solution; incubating it in buffer solution, then treating it with phosphotungstic acid, and drying it with ethanol containing hexamethyldisilazane. SEM samples were obtained and SEM was detected. The kit can be used for SEM detection of biological samples with good repeatability and high accuracy.

【技术实现步骤摘要】
一种适用于生物样本的SEM检测样品制备试剂盒及其应用
本专利技术属于检测试剂盒领域，具体是指一种适用于外泌体，细胞，细菌，病毒或生物组织等生物样本进行SEM(扫描电子显微镜)检测用的检测样品制备制剂盒及其应用。
技术介绍
扫描电子显微镜(SEM)是介于透射电镜和光学显微镜之间的一种微观形貌观察工具，主要是利用二次电子信号成像来观察样品的表面形态，即用极狭窄的电子束去扫描样品，通过电子束与样品的相互作用产生各种效应，其中主要是样品的二次电子发射效应，基于二次电子能够产生样品表面放大的形貌像，这个像是在样品被扫描时按时序建立起来的，即使用逐点成像的方法获得放大像。现有技术中，很多生物样本(例如外泌体，细胞，细菌，病毒或生物组织)不能很好的直接用扫描电子显微镜或原子力显微镜观察，需要对生物样本进行处理，让生物样本能够匹配SEM，才能观察分析。已有的可以利用喷金等手段，对生物样本表面喷镀金属，使得生物样本表面具有导电性，更好的观察。然而，喷镀金属可能导致生物样本细微结构的损失，喷镀不均匀也可能导致是实验结果重复性差，分析结果出现偏差。因此有必要对此进行改进。
技术实现思路
本专利技术实施例所要解决的技术问题在于，提供一种适用于生物样本检测的SEM样品试剂盒。通过该试剂盒对生物样本进行处理成检测样品，可以保持生物样本的原结构形态，而且检测实验结果一致性好。为实现上述目的，本专利技术的技术方案是该试剂盒包括有多孔板，多孔板的孔内设置有多聚赖氨酸修饰的硅片及SEM检测试剂。SEM检测试剂包括有PBS缓冲液、戊二醛、PFA多聚甲醛、磷钨酸水溶液、六甲基二硅氮烷和乙醇。本专利技术提供了一种基于所述的SEM样品试剂盒的SEM检测方法，包括有以下步骤：1)将多聚赖氨酸修饰的硅片置于多孔板的一个孔中；2)将待测生物样本溶液滴加在多孔板内的的多聚赖氨酸修饰的硅片上，孵育；3)除多余的生物样本溶液；4)加入1XPBS缓冲液，并在1XPBS缓冲液中添加2wt％戊二醛、4wt％PFA多聚甲醛，4℃孵育30min-16h；5)用1XPBS缓冲液清洗；6)加入0.1-1％磷钨酸处理；7)超纯水清洗；8)再依次用30％、50％、70％、90％的乙醇处理5min；9)100％乙醇处理5min，重复2次；10)含50％体积比六甲基二硅氮烷的乙醇处理15-30s；11)100％六甲基二硅氮烷处理15-30s；12)去除六甲基二硅氮烷；13)置于在真空干燥器中干燥；14)然后将经上述步骤处理后的多聚赖氨酸修饰的硅片置于SEM上检测。进一步设置是所述的待测生物样本溶液为含有外泌体，细胞，细菌，病毒或生物组织的生理缓冲溶液。本专利技术的优点是：(1)通过本专利技术提供了多聚赖氨酸的硅片，具有非常优秀的亲水性，有利于生物样本在硅片表面吸附，提高制样成功率，便于观察；(2)通过本专利技术的检测步骤，采用磷钨酸处理，使得生物膜结构具有更好的导电性，有利于SEM观察。(3)采用不同浓度的六甲基二硅氮烷分断处理，六甲基二硅胺与空气接触后迅速水解，生成能溶于多种有机溶剂的六甲基二硅醚和三甲硅烷醇，这种性质决定其能迅速将样品中的脱水剂及残留水份进行置换，快速充分地干燥样品，免受大气压力对组织的损伤，从而使得组织的三维立体微细结构保存在活体状态；(4)本专利技术能够有效保持待测生物样品形貌的稳定性，从而使得SEM检测实验结果重复性好，分析结果准确性高。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本专利技术的范畴。图1原始Si的接触角测试图；图2经过本专利技术工艺处理后的Si的接触角测试图；图3本专利技术三个实施例的SEM检测图(从左到右依次排列)。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本专利技术作进一步地详细描述。制备实施例1.外泌体的SEM检测：1)将PolyL-Lysine-硅片置于孔板的一个孔中2)将10μL含外泌体的生理缓冲液滴加在PLL包被的Si片上，4℃孵育一晚3)除多余的含外泌体的生理缓冲液4)加入1XPBS(含2％戊二醛、4％PFA多聚甲醛)，4℃孵育30min5)用1XPBS清洗2次6)加入磷钨酸处理7)超纯水清洗3次8)分别用30％-50％-70％-90％的乙醇处理5min9)100％乙醇处理5min，重复2次10)含50％HMDS的乙醇处理15～30s11)100％HMDS处理15～30s12)去除HMDS13)置于在真空干燥器中干燥过夜14)SEM测试，SEM检测外泌体的图片，参见图1(左边)所示。实施例2培养的细胞观察1)在培养皿中细胞覆盖率达到70-80％时，去除培养皿中培养基；2)加入2％戊二醛、4％多聚甲醛)(1XPBS配置)，4℃，过夜；3)去除固定液，用1xPBS快速清洗2遍4)加1％磷钨酸(用超纯水配置)，4℃，4h5)用超纯水快速清洗3遍6)30％-50％-70％-90％乙醇梯度脱水，4℃，15min7)无水乙醇，室温，2次各15min8)依次用50％HMDS的乙醇溶液、100％HMDS处理2min9)去除HMDS后置于真空干燥箱中10)激光切割皿底得到8×8mm聚苯乙烯片(激光切割参数：最大/最小功率：30％,速度：10mm/s)11)将有细胞的一面朝上，固定在金属底座上，用SEM成像。实施例3组织样本SEM成像1)将小鼠麻醉处死，取出眼球在预冷固定液中固定5-10min；2)在体式显微镜下，找到小梁网组织，去除晶状体和玻璃体。在取材时要注意避免挤压损伤、避免外力对观察面的损伤和破坏。3)分离的小梁网组织先用预冷0.1MPBS冲洗后，立刻放入0.1MPH7.4PBS(含2％戊二醛+4％多聚甲醛)中，4℃固定12h。4)固定后用刀切出平整的小梁网截断面。5)固定后，用0.1MPBS(PH7.4)清洗3遍，4℃每次10min。6)再用1％磷钨酸4℃处理过夜。7)用0.1MPBS(PH7.4)清洗3遍，4℃每次10min。8)30％-50％-70％-90％乙醇梯度脱水，均为10min、4℃。9)100％乙醇脱水两次，均为10min、4℃。10)再用含50％HMDS的乙醇、而后100％HMDS处理，分别2min，室温。11)除去HMDS后，在真空干燥器冷冻干燥器中干燥1晚，后干燥保存待用。12)用导电胶将组织固定于金属底座上，横断面朝上，利用SEM成像。本专利技术的试剂盒还可以分别用于SEM检测细胞，细菌，病毒或生物组织等生物样品。以上所揭露的仅为本专利技术较佳实施例而已，当然不能以此来限定本专利技术之权利范围，因此依本专利技术权利要求所作的等同变化，仍属本专利技术所涵盖的范围。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种适用于生物样本检测的SEM样品试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括有多孔板，多孔板的孔内设置有多聚赖氨酸修饰的硅片，及SEM检测的试剂。

【技术特征摘要】
1.一种适用于生物样本检测的SEM样品试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括有多孔板，多孔板的孔内设置有多聚赖氨酸修饰的硅片，及SEM检测的试剂。2.根据权利要求1所述的一种适用于生物样本检测的SEM样品试剂盒，其特征在于：所述的多聚赖氨酸修饰的硅片通过以下步骤制备：(1)切割出统一尺寸规格的硅片；(2)将硅片进行清洗；(3)对硅片进行亲水处理，分别在硫酸、氨水水溶液中水浴加热处理10min；(4)将(3)所得硅片用氮气吹干；(5)将干燥的硅片置于培养板中，并加入0.1-1％多聚赖氨酸，孵育；(6)将(5)所得硅片用1XPBS缓冲液清洗，得到多聚赖氨酸修饰的硅片。3.根据权利要求1所述的适用于生物样本检测的SEM样品试剂盒，其特征在于：所述的步骤(2)为分别在洗涤灵、甲醇、丙酮、去离子水中依次超声清洗15min。4.一种基于权利要求1所述的SEM样品试剂盒的SEM检测方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈欲超，
申请(专利权)人：温州汇芯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33