诊断伴随过度细胞死亡的疾病的方法以及用于其实施的试剂盒技术

本发明专利技术涉及医学，具体涉及实验室诊断，并涉及伴随细胞死亡增加的疾病的诊断和用于其实施的试剂盒。从个体获得血浆样品，然后进行血浆中核酸的等温扩增。然后从反应混合物中纯化核酸，并通过实时聚合酶链式反应方法进行核酸定量分析。在测试中确定系数К，如(I)所示。其中，Ct为聚合酶链式反应阈值循环的值。然后将系数К与参考值进行比较，当系数К值小于参考值，则诊断为伴随细胞死亡增加的疾病。还提供了用于执行伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法的试剂盒。本发明专利技术使得可以以高灵敏度在疾病的任何阶段(包括不存在临床症状的早期阶段)进行伴随细胞死亡增加的疾病的微创诊断。К＝C1或

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】诊断伴随过度细胞死亡的疾病的方法以及用于其实施的试剂盒本专利技术涉及医学，特别涉及实验室诊断，它可用于诊断伴随细胞死亡增加的疾病。人体血液具有与细胞无关并在血流中自由循环的核酸(NA)。这些NA似乎是细胞死亡(衰减)的结果，其与所有器官内的新细胞连续替换旧细胞相关。在健康人的血浆中，自由循环DNA(cfDNA，无细胞DNA)的浓度约为6ng/ml。一些疾病伴随着细胞死亡的增加，并因此伴随着患者血浆中的cfDNA浓度的增加。这些疾病的例子主要是肿瘤疾病以及一些肝脏疾病，特别是肝病[O.V.Zairayants等，病理解剖学，第1章，细胞和组织损伤和死亡.2012年，960页]。恶性肿瘤生长通常伴随着细胞死亡的增加。恶性细胞主要通过坏死而死亡，在较小程度上通过细胞凋亡而死亡；细胞碎片进入血管。这就是为什么与健康个体相比，大多数肿瘤患者的血浆中的cfDNA浓度增加。已经证实肿瘤患者的cfDNA来源于恶性细胞[HuangZ.H.等.乳腺癌患者在诊断及随访期间血浆循环DNA的定量分析“QuantitativeanalysisofplasmacirculatingDNAatdiagnosisandduringfollow-upofbreastcancerpatients”.癌症通讯(CancerLett).2006,243：64-70]。此外，这种cfDNA可以在某些条件下诱导细胞的致癌性转化[Garcia-OlmoD.C.等.在结肠直肠癌患者的血浆中循环的无细胞核酸诱导易感的培养细胞的致癌性转化“Cell-freenucleicacidscirculatingintheplasmaofcolorectalcancerpatientsinducetheoncogenictransformationofsusceptibleculturedcells”.癌症研究.2010,70：560-567]。癌细胞的能量代谢不同于健康细胞。在癌细胞中观察到无氧糖酵解增加以及线粒体DNA(mtDNA)的拷贝数随着不同癌症类型发生变化(8)。在前列腺癌和卵巢癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、某些类型的白血病、结肠癌、脑癌、颈癌和其他形式的癌症情况下发现mtDNA拷贝数增加。相反，在胃癌、肝癌、乳腺癌和其他形式的癌症情况下发现mtDNA拷贝数减少。许多因素如年龄、氧化应激、组织特异性和肿瘤生长程度都会影响mtDNA拷贝数[MengS.等.人类癌症中线粒体DNA拷贝数的改变“MitochondrialDNAcopynumberalterationinhumancancers”.NAJMedSci.2013,6(1)：22-25.DOI：10.7156/najms.2013.0601022]。基于mtDNA结构的分析，Mitomics公司[www.mitomicsinc.com]所用的肿瘤疾病诊断方法和用于方法实施的试剂盒，其包括缺失的突变是已知的。Mitomics公司最成熟的测试是前列腺癌(前列腺核心Mitomics测试，PCMT)的测试。检测灵敏度为85％，特异性为92％。该方法的缺点如下：侵入性，分析使用前列腺活检材料，这是一个痛苦的过程。为了获得上述灵敏度和特异性参数，需要重复的活组织检查。该公司继续致力于使用该方法诊断其他形式的癌症。在文献中有许多关于总cfDNA、个体基因、血浆和血清中mtDNA的分析的工作[MehraN.等人.循环线粒体核酸对晚期前列腺癌患者的存活具有预后价值“Circulatingmitochondrialnucleicacidshaveprognosticvalueforsurvivalinpatientswithadvancedprostatecancer”.临床癌症研究.2007,13：421-426；XiaP.等人.(2009年)。通过多重实时PCR同时定量评估无循环细胞的线粒体和核DNA“Simultaneousquantitativeassessmentofcirculatingcell-freemitochondrialandnuclearDNAbymultiplexreal-timePCR”.Gen.Mol.Biology，32,1,20-24；http://core-genomics.blogspot.ru/2014/12/extracting-cell-free-dna-from-plasma.html；PLoSOne.(2014年3月3日；9(3)：e87838.doi：10.1371/journal.pone.0087838.eCollection2014]。在XiaP.等人的工作分析了健康供体的基因组DNA和mtDNA。上述和类似工作的主要缺点在于从血浆中提取DNA。自从核酸提取的生物化学方法出现以来，研究人员知道DNA部分的丢失和基因定量的变化随着提取而发生。核心基因组学(CoreGenomics)公司对不同公司的试剂盒进行了比较，并确定损失高达40％[http://core-genomics.blogspot.ru/2014/12/extracting-cell-free-dna-from-plasma.html]。在没有进行初步扩增的情况下尝试评估患者的cfDNA含量[PLoSOne.(2014年3月3日；9(3)：e87838.doi：10.1371/journal.pone.0087838.eCollection2014]。但是，由于健康患者血浆中的DNA浓度在1.6-23.7ng/ml之间变化，并且该工作的数据显示，对于患者来说，在5.1-183ng/ml之间变化，因此不可能仅通过血浆中DNA或某些基因的量来诊断疾病。本专利技术的任务是创建用于伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法和用于方法执行的试剂盒，其基于血浆中游离循环核酸的定量，而无需事先提取。该任务通过创建伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法来解决，其包括以下内容：a)人体血浆采样；b)血浆的等温核酸扩增；c)从根据b)项制备的反应混合物中纯化核酸；d)通过实时聚合酶链式反应方法定量核酸，并测定样品中的К系数，如下：К＝C1或或或其中Ct–聚合酶链式反应阈值循环的值；e)比较К系数与参考值；f)诊断伴随细胞死亡增加的疾病，同时К系数值小于参考值。在具体的实施例中，伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法的特征在于，在没有从血浆中初步分离核酸的情况下进行血浆的等温核酸扩增。在具体的实施例中，伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法的特征在于，血浆的等温核酸扩增在含血浆的相同管中进行。在具体的实施例中，伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法的特征在于，血浆核酸包括基因组DNA、线粒体DNA、信使RNA、转运RNA、微小RNA和外泌体核酸。在具体的实施例中，伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法的特征在于，疾病是肿瘤疾病，其伴随着细胞死亡的增加。在具体的实施例中，肿瘤疾病的诊断方法的特征在于，所述肿瘤疾病选自下组：乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、胸腺癌、前列腺癌、卵巢癌、脑胶质瘤。在具体的实施例中，伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法的特征在于，疾病是肝病，伴随着细胞死亡的增加。在具体的实施例中，伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法的特征在于，参考值被确定为通过健康群本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：a)人血浆采样；b)血浆的等温核酸扩增；c)从根据步骤b)制备的反应混合物中纯化核酸；d)通过实时聚合酶链式反应方法进行核酸定量，并测定样品中的系数К，如下所示：К＝C1或

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.02.05 RU 20161036851.一种伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：a)人血浆采样；b)血浆的等温核酸扩增；c)从根据步骤b)制备的反应混合物中纯化核酸；d)通过实时聚合酶链式反应方法进行核酸定量，并测定样品中的系数К，如下所示：К＝C1或或或其中–聚合酶链式反应阈值循环的值；e)К系数与参考值的比较；f)К系数值小于参考值，诊断伴随细胞死亡增加的疾病。2.如权利要求1所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，从血浆中没有初步分离核酸的情况下进行血浆的等温核酸扩增。3.如权利要求1所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，血浆的等温核酸扩增在装有血浆的相同的管中进行。4.如权利要求1所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，血浆核酸包括基因组DNA、线粒体DNA、信使RNA、转运RNA、微小RNA、外泌体核酸。5.如权利要求1所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，所述伴随细胞死亡增加的疾病是肿瘤疾病。6.如权利要求5所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，所述肿瘤疾病选自下组：乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、胸腺癌、前列腺癌、卵巢癌、脑胶质瘤。7.如权利要求1所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，所述伴随细胞死亡增加的疾病是肝病。8.如权利要求1所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，所述参考值被确定为通过健康群体筛查获得的К系数的平均值。9.如权利要求1所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，所述伴随细胞死亡增加的疾病是乳腺癌，并且所述参考值等于2。10.如权利要求1所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，所述伴随细胞死亡增加的疾病是肝病，并且所述参考值等于2。11.如权利要求1所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，所述糖酵解酶选自下组：己糖激酶、磷酸葡萄糖异构酶、磷酸果糖激酶、果糖二磷酸醛缩酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸甘油醛脱氢酶、磷酸甘油酸酯激酶、磷酸甘油酸变位酶、烯醇酶和丙酮酸激酶。12.如权利要求所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，所述线粒体DNA片段选自线粒体基因组，包括转运RNA基因、12S核糖体基因、16S核糖体基因、NADH-脱氢酶亚基因、细胞色素氧化酶亚基因、ATP合成酶亚基因和细胞色素C还原酶基因。13.如权利要求1所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，使用DNA聚合酶phi29进行血浆的等温核酸扩增。14.如权利要求13所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，使用结合单直链DNA的蛋白质、海藻糖、随机引物、去垢剂、脱氧核苷三磷酸酯、氯化镁进行血浆的等温核酸扩增。15.如权利要求14所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，所述随机引物是随机-7硫代。16.如权利要求1所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，通过向反应混合物中加入乙二胺四乙酸酯来终止血浆的等温核酸扩增。17.如权利要求16所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，在终止血浆的等温核酸扩增后，进行DNA提取。18.如权利要求17所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，所述DNA纯化如下进行：将蛋白酶К加入到所述反应混合物中，将所述反应混合物在55℃孵育15分钟，用试剂处理反应混合物，用异丙醇沉淀DNA，并且用乙醇洗涤DNA。19.如权利要求18所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，提取的DNA溶解在TE缓冲液中，并确定其浓度。20.如权利要求1所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，编码糖酵解酶的基因是编码丙酮酸激酶的基因。21.如权利要求20所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，使用一对寡核苷酸引物和用于检测的寡核苷酸探针来确定丙酮酸激酶基因的Ct；而且，一个寡核苷酸引物具有与SEQIDNO：1序列至少90％同源性的序列，第二寡核苷酸引物具有与SEQIDNO：2序列至少90％同源性的序列，用于检测的寡核苷酸探针具有与SEQIDNO：3序列至少90％同源性的序列。22.如权利要求20所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，使用一对寡核苷酸引物和用于检测的寡核苷酸探针来确定丙酮酸激酶基因的Ct；而且，一个寡核苷酸引物具有SEQIDNO：1序列，第二寡核苷酸引物具有SEQIDNO：2序列，用于检测的寡核苷酸探针具有SEQIDNO：3序列。23.如权利要求1所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，使用一对寡核苷酸引物和用于检测的寡核苷酸探针来确定NC_018923.2第12染色体片段的Ct；并且，一个寡核苷酸引物具有与SEQIDNO：4序列至少90％同源性的序列，第二寡核苷酸引物具有与SEQIDNO：5序列至少90％同源性的序列，用于检测的寡核苷酸探针具有与SEQIDNO：6序列至少90％同源性的序列。24.如权利要求1所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，使用一对寡核苷酸引物和用于检测的寡核苷酸探针来确定NC_018923.2第12染色体片段的Ct；并且，一个寡核苷酸引物具有SEQIDNO：4序列，第二寡核苷酸引物具有SEQIDNO：5序列，用于检测的寡核苷酸探针具有SEQIDNO：6序列。25.如权利要求1所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，使用一对寡核苷酸引物和用于检测的寡核苷酸探针，来确定M6PRBP基因的Ct；并且，一个寡核苷酸引物具有与SEQIDNO：7序列至少90％同源性的序列，第二寡核苷酸引物具有与SEQIDNO：8序列至少90％同源性的序列，用于检测的寡核苷酸探针具有与SEQIDNO：9序列至少90％同源性的序列。26.如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·A·梅尔尼科夫，
申请(专利权)人：生物标记RU有限责任公司，
类型：发明
国别省市：俄罗斯,RU