一种快速检测花粉活力的方法技术

本发明专利技术提供了一种快速检测花粉活力的方法，其按如下步骤进行：（1）选取花粉样本；（2）花粉近红外光谱采集；（3）花粉近红外光谱预处理；（4）花粉活力近红外定标校正模型的建立。当验证相对分析误差RPDCV≥3.0，则该定标方程预测效果极准确；当RPDCV≥2.5时，该定标方程可以用于日常分析检测。近红外光谱检测砀山梨花粉与扁桃花粉活力平均效率分别是其他花粉活力检测方法的955.7倍与771.4倍；活力精确率分别是其他花粉活力检测方法的6.3倍与5.6倍。适用本发明专利技术能够精准预测花粉活力，检测准确可靠，可直接应用于花粉活力的检测，具有广阔的发展前景。

A method for rapid detection of pollen viability

The invention provides a method for rapid detection of pollen vigor, which is carried out in the following steps: (1) selecting pollen samples; (2) collecting pollen near infrared spectroscopy; (3) pretreatment of pollen near infrared spectroscopy; (4) establishing a calibration model of pollen vigor near infrared spectroscopy. When the relative analysis error RPDCV (>3.0) is verified, the calibration equation can be used for routine analysis and detection. Near infrared spectroscopy was 955.7 times and 771.4 times as effective as other methods for detecting pollen viability of Dangshan pear and almond respectively, and the accuracy was 6.3 times and 5.6 times as high as other methods for detecting pollen viability. The invention can accurately predict the pollen vigor, the detection is accurate and reliable, and can be directly applied to the detection of pollen vigor, and has broad development prospects.

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测花粉活力的方法
本专利技术涉及植物良种繁育的
，具体的涉及一种快速检测花粉活力的

技术介绍
花粉是高等植物的雄配子体，它在有性繁殖中传递着雄性亲本的遗传信息。花粉既是植物遗传、育种、进化、生殖等研究的重要对象，又是孢粉分析、蜂群培育、药物制造、医疗及生理试验等的重要材料。花粉生活力是花粉具有存活、生长、萌发或发育的能力。在农业和林业的常规育种中，为了进行人工辅助授粉或杂交授粉，需要早期采集和贮存花粉。尤其是在杂交育种工作中，研究花粉的生活力和育性是必不可少的基础性工作。为了解决亲本花期不一致或远距离杂交的困难，更需要保存花粉的活力。在使用采集和贮存花粉之前，通常要做花粉生活力的鉴定。不同类群植物花粉在自然条件下的寿命、花粉的适宜贮存条件以及花粉生活力的适宜测定方法均有所差异。这些差异对于研究花粉贮藏期间控制花粉生活力、花粉柱头间的相互作用、品种改良与育种操作、基因库的保持、不亲和性与受精关系、生理调节对花粉萌发的影响以及基因流等均有重要的实践意义。目前花粉活力检测采用了不同的方法，主要有以下几种：I2-KI染色法的基本原理是：根据淀粉遇碘变蓝的特性，根据蓝色的深浅程度来判断花粉粒中淀粉的含量，从而确定花粉粒活性的高低。该方法的局限在于，它是靠花粉粒内的淀粉着色而进行判定的。虽然花粉失去了活力，但是淀粉依然存在，所以测定值偏高，而且对于那些淀粉含量少的种类如菊属不适宜。TTC即2，3，5-氯代三苯基四氮唑，它是一种氧化还原染料。TTC染色法的基本原理是：当TTC渗入细胞后，可被呼吸代谢中的还原酶所还原，并由无色的氧化型变成红色的还原型，由此来判断花粉的生活力。该方法已应用于黄瓜、枇杷、猕猴桃、番木瓜、瓜叶菊、芸薹属、百合等的花粉生活力检测。但该方法耗时长，染色后花粉的颜色差别很小，不易分辨，且颜色受染色时间的影响较大，不便统计。FCR染色法即荧光染料反应法(FluorochromeReaction)，其基本原理是：荧光染料本身不产生荧光，无极性，可以自由地透过完整的原生质膜，当这种染料进入原生质后，即被酯酶作用而形成一种能产生荧光的极性物质(荧光素)，并且这种物质不能自由出入原生质膜，而只在细胞内积累，所以可以根据花粉产生荧光的情况判断花粉的生活力。而且，该方法可同时反映出酶活和质膜情况2个指标。该方法与萌发测定有相关性，对亲本与F1代的鉴别非常有效，但稳定性差，需要重复测定，估计值偏高，测定时间长，15min后就会退色，所以必须在落射荧光显微镜下观察。联苯胺染色法，联苯胺染色法又称过氧化物酶染色法或B.C夏尔达考夫染色法。基本原理是根据花粉中过氧化物酶的活性来判断花粉的生活力。该方法主要是由于有活力的花粉含有活跃的过氧化物酶，所用试剂能与该酶发生氧化而染色。但是随着花粉生活力的丧失，该酶活性不消失，所以仍能染色，因此，测定值偏高。而且笔者在研究蜡梅花粉生活力时发现，在显微镜下难以区分红色和黄色，染色界线不分明，与萌发测定没有相关性。MTT染色法是根据花粉粒中脱氢酶的活性判断花粉生活力，适用试剂是四唑盐类染料。该方法的缺点是与萌发测定不相关，染色后花粉的颜色差别很小，不易分辨，导致测定值偏高，所以应用很少。X-Gal染色法是根据花粉中B-半乳糖苷酶的存在与否来测定花粉生活力。缺点是对花粉的生活力估计偏高，也可使死亡花粉着色。P-苯二胺测定法(p-phenylenediamine-peroxidase-test，简称ppp-test)。P-苯二胺法的基本原理是通过检测花粉中髓过氧化物酶的存在与否来判断花粉生活力。死花粉与活花粉染色差异非常明显，易于鉴定，适于野外操作。但由于药品对温度和光敏感，所以必须在暗处操作。离体萌发测定法其根据是将花粉粒平铺在培养基上或与液体培养基混合，在适宜温湿度条件下，由培养基提供花粉萌发时需要的水分及能量。以花粉萌发出花粉管的长度等于花粉直径作为花粉萌发的标志。利用显微镜观测花粉萌发的个数，计算其萌发率，以此作为花粉生活力的标准。但是花粉萌发率与培养温度、营养物质、矿质元素等因素密切相关，因此培养基条件有差异时结果也有差异。加之此法操作复杂影响因素多较难掌握；涂抹花粉耗时长且不易涂抹均匀。活体萌发测定法根据是具有花粉管的花粉粒能被锚定在柱头上，且不会被漂洗掉，然后漂洗柱头和比较漂洗前后柱头上的花粉粒数目来测花粉萌发率。总体上，染色法简单、迅速，能够在一定程度上直接反映花粉的代谢情况或营养含量，但受花粉自身特性的影响较大，不能直接表现花粉的萌发率。因此，不同的染色法只适合某些植物花粉生活力的测定。离体萌发测定法可以直观区分死亡或缺乏活力的花粉，数据可靠，但需要依据不同种类配制不同的培养基，在适宜的温度、湿度等培养条件下测定其生活力，耗时相对较长。活体萌发测定法精确，模拟了自然状态下的受精状况，但仅适合于感受性柱头，测定结果可能偏低，柱头的表面性质对所测试样有限制。田间授粉测定法准确但速度太慢，不利于生产，而且还受到田间气候、环境条件及母本植株性状的影响，测定结果明显低于染色法。目前使用的花粉活力测定方法或多或少都有一些缺点，因此亟需一种简洁快速、操作简单、使用安全、且花粉活力测定值准确可靠的新方法来测定花粉的生活力。近红外光谱法是近年来分析化学领域发展较为迅猛的新兴光谱分析方法，具有方便、快速、高效、准确、不破坏样品、不消耗化学试剂、不污染环境的检测技术等特点。近红外光谱是介于可见光和中红外光之间的电磁波谱，波长区域约为780-2526nm。近红外光谱法是利用含氢基团(C-H、O-H、N-H、S-H、P-H等)分子内振动的非谐振性从基态向高能级跃迁产生的倍频和合频吸收光谱，在近红外区的吸收光谱，通过选择适当的化学计量学多元校正方法，把校正样品的近红外吸收光谱与其成分浓度或性质数据进行关联，建立校正样品吸收光谱与其成分浓度或性质之间的关系-校正模型。在进行未知样品预测时，应用已建好的校正模型和未知样品的吸收光谱，就可以定量预测其成分浓度或性质。另外，通过选择合适的化学计量学模式识别方法，也可分离提取样本的近红外吸收光谱特征信息，并建立相应的模型。在进行未知样品的分类时，应用已建立的模型和未知样品的吸收光谱，便可定性判别未知样品的归属。近红外光谱最早成功的用于农产品的品质分析，进而扩展到污染物的测定，烟草、咖啡的分类、农产品产地来源鉴别，还用于检测可耕土壤的物理和化学变化，光导纤维探头的出现，近红外检测技术可直接用于粮食或水果传送带上进行产品分捡。近红外检测技术不仅作为常规方法用于食品的品质分析，而且已用于食品加工过程中组成变化的监控和动力学行为的研究，如用近红外检测评价微型磨面机在磨面过程化学成分的变化；在奶酪加工过程中优化采样时间，研究不同来源的奶酪的化学及物理动力学行为；通过测定颜色变化来确定农产品的新鲜度、成熟度，了解食品的安全性；通过检测水分含量的变化来控制烤制食品的质量；检测苹果、葡萄、梨果汁加工过程中可溶性和总固形物的含量变化。近年来，在农产品的良种选育和品质分析中发挥了重要作用。目前虽然我国近红外检测技术的研究在某些方面已达到国际先进水平，但花粉活力检测还未应用。
技术实现思路
针对现有花粉检测技术中，花粉检测中使用对人体有害药品，测本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速检测花粉活力的方法，其特征在于，按如下步骤进行：（1）选取花粉样本：将200g花粉封装在20个纸质包装中，放在4℃下贮藏，花粉贮藏0天时测定20份花粉活力值、贮藏7天时测定20份花粉活力值、贮藏27天时测定20份花粉活力值、贮藏43天时测定20份花粉活力值、贮藏65天时测定20份花粉活力值，由此组成100份花粉活力测定值定标集，测定完成后继续放入4℃下贮藏；（2）花粉近红外光谱采集：利用NIRSystems Lab 5000近红外分析仪进行100份花粉样品的近红外光谱收集，采集的波长范围设定在1100~2498nm的近红外波段，波长间隔2nm，每个样品重复装样扫描两次转化为log1/R形式记录光谱数据；（3）花粉近红外光谱预处理：花粉近红外原始光谱经标准正态变量校正与去除趋势SNVD并结合导数处理；（4）花粉活力近红外定标校正模型的建立：使用化学计量学定标软件WinISI Ⅲ进行数据分析和定标。

【技术特征摘要】
1.一种快速检测花粉活力的方法，其特征在于，按如下步骤进行：（1）选取花粉样本：将200g花粉封装在20个纸质包装中，放在4℃下贮藏，花粉贮藏0天时测定20份花粉活力值、贮藏7天时测定20份花粉活力值、贮藏27天时测定20份花粉活力值、贮藏43天时测定20份花粉活力值、贮藏65天时测定20份花粉活力值，由此组成100份花粉活力测定值定标集，测定完成后继续放入4℃下贮藏；（2）花粉近红外光谱采集：利用NIRSystemsLab5000近红外分析仪进行100份花粉样品的近红外光谱收集，采集的波长范围设定在1100~2498nm的近红外波段，波长间隔2nm，每个样品重复装样扫描两次转化为log1/R形式记录光谱数据；（3）花粉近红外光谱预处理：花粉近红外原始光谱经标准正态变量校正与去除趋势SNVD并结合导数处理；（4）花粉活力近红外定标校正模型的建立：使用化学计量学定标软件WinISIⅢ进行数据分析和定标。2.以最高的交互验证相关系数（1-VR）和最低的交互验证标准差（SECV）为标准，...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐叶挺，龚鹏，张校立，庄红梅，代培红，王娟，杨波，郭春苗，侯献飞，王斐，
申请(专利权)人：新疆农业科学院园艺作物研究所，
类型：发明
国别省市：新疆,65