一种双壳贝类精子质量检测的方法技术

本发明专利技术提供了一种双壳贝类精子质量检测方法，该方法结合荧光染料双染与流式细胞术来检测双壳贝类精子质量，包括如下步骤：首先调整精液浓度，然后以透膜的荧光染料及不透膜的荧光染料与待测精液进行染色，室温孵育，流式细胞术检测，得出检测结果，所述透膜的荧光染料能够与线粒体膜结合，不透膜的荧光染料可以穿过破损的细胞膜，并与胞内的核酸特异性结合。本发明专利技术通过一次检测可同时获得多个参数结果，不仅能够清晰地区分不同状态的精子并显示其比例，得出精子死亡率、存活率、质膜受损率以及具线粒体活性比例，还可以避免主观因素造成的精确率较低的现象，确保检测结果的准确性。

A method for detecting sperm quality of bivalve mollusk

The invention provides a method for detecting the sperm quality of bivalve shellfish. The method combines fluorescent dye double-staining with flow cytometry to detect the sperm quality of bivalve shellfish, including the following steps: first adjusting the sperm concentration, then dyeing the sperm with the permeable fluorescent dye and the impermeable fluorescent dye, and incubating at room temperature. Flow cytometry showed that the permeable fluorescent dye could bind to the mitochondrial membrane, and the impermeable fluorescent dye could penetrate the damaged cell membrane and specifically bind to the nucleic acid in the cell. The invention can obtain the results of multiple parameters at the same time by one test, not only can the sperm of different states be clearly distinguished and its proportion displayed, but also the sperm mortality rate, survival rate, plasmalemma damage rate and the proportion with mitochondrial activity can be obtained, and the phenomenon of low accuracy caused by subjective factors can be avoided, so as to ensure the test results. Accuracy.

【技术实现步骤摘要】
一种双壳贝类精子质量检测的方法
本专利技术涉及一种双壳贝类精子质量检测方法，尤其涉及一种精子受到胁迫之后，检测精子存活率、质膜完整性及线粒体活性的方法及应用。
技术介绍
目前，双壳贝类精子质量检测方法均为镜检。将精子置于光学显微镜下，观察精子的运动时间、运动比例及运动的激烈程度。但是，由于每个人的经验和判断标准不同，再加上观察精子存活的时间间隔太长，这类方法往往具有较大的主观性和不准确性，易对实验的精确性造成影响，容易得出错误结论。计算机辅助精子分析系统（CASA）的应用，使精子质量的研究得到较大改善，通过对精子运动轨迹、速度及动态参数的分析，从而鉴定精子的质量。CASA虽然能够对精子密度和活力等参数进行测定，但是其具有一定的局限性，不能检测精子内部结构的变化，尤其是经冷冻保存或者受胁迫的精子，因其质膜完整性和线粒体活性易受到损伤，对精子的质量影响显著。在贝类精子质量的研究中，对精子进行两种荧光染料染色使精子释放不同颜色的荧光，然后在荧光显微镜下随机计数，统计精子的存活率，此类方法虽然能够检测精子内部结构的变化，但是存在较大误差，且费时费力。因此，现在迫切需要一种精确的精子质量检测方本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种双壳贝类精子质量检测的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：（1）精液制取：选择发育饱满的个体，解剖镜检，选出性腺发育好的雄性个体，用吸管吸取精子置于灭菌海水中；（2）荧光染液配制：将PI和Rh123分别溶于超纯水中，储存；（3）精液染色：取一定量精液，加入两种上述荧光染液混合，放置、离心，洗涤，重悬，再进行流式细胞仪检测；（4）流式细胞仪检测结果：经PI/Rh123染色和FCM检测的精子分布在不同的象限：R1表示质膜破坏线粒体无活性的死精子，R2表示质膜破裂但线粒体仍具有活性，也就是即将死亡的精子，R3表示质膜正常但无线粒体跨膜电位的精子，R4为正常的活精子。

【技术特征摘要】
1.一种双壳贝类精子质量检测的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：（1）精液制取：选择发育饱满的个体，解剖镜检，选出性腺发育好的雄性个体，用吸管吸取精子置于灭菌海水中；（2）荧光染液配制：将PI和Rh123分别溶于超纯水中，储存；（3）精液染色：取一定量精液，加入两种上述荧光染液混合，放置、离心，洗涤，重悬，再进行流式细胞仪检测；（4）流式细胞仪检测结果：经PI/Rh123染色和FCM检测的精子分布在不同的象限：R1表示质膜破坏线粒体无活性的死精子，R2表示质膜破裂但线粒体仍具有活性，也就是即将死亡的精子，R3表示质膜正常但无线粒体跨膜电位的精子，R4为正常的活精子。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，使用血球计数板调整精子浓度为107~108个/mL。3.如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：王昭萍，杜俊鹏，于瑞海，马培振，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东,37