一种CIK细胞激活剂魏察苦蘵素A的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种CIK细胞激活剂魏察苦蘵素A的制备方法。本发明专利技术发现，表原莪术烯醇、莪术烯醇、苦蘵内酯A、苦蘵内酯F和魏察苦蘵素A可以激活CIK细胞中颗粒酶B的表达，为有效的颗粒酶B激活剂；颗粒酶B激活剂表原莪术烯醇、莪术烯醇、苦蘵内酯A、苦蘵内酯F和魏察苦蘵素A可以显著提高CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤力。本发明专利技术还提供了制备表原莪术烯醇、莪术烯醇、苦蘵内酯A、苦蘵内酯F和魏察苦蘵素A的方法，该方法不依赖于反复柱层析，适用于工业化大规模制备。现有技术没有公开过本发明专利技术公开的技术方案。

A preparation method of CIK cell activating agent A

The invention discloses a preparation method of CIK cell activator, A. The present invention shows that epicurenol, curcumenol, galactone A, galactone F and berberine A can activate the expression of granzyme B in CIK cells and are effective activators of granzyme B; epicurenol, curcumenol, galactone A, galactone F and berberberine A can be significant activators of granzyme B. To enhance the lethality of CIK cells to tumor cells. The invention also provides a method for preparing epicurenol, curcumenol, galactone A, galactone F and weichaku A, which does not depend on repeated column chromatography and is suitable for industrial large-scale preparation. The existing technology has not disclosed the technical proposal disclosed in the invention.

【技术实现步骤摘要】
一种CIK细胞激活剂魏察苦蘵素A的制备方法
本专利技术属于生物领域，具体涉及CIK细胞的培养及诱导化合物的制备方法。
技术介绍
恶性肿瘤严重危害人类健康，目前常规的手术和放化疗治疗方法均不能彻底清除体内的瘤细胞，过继免疫治疗法因具有符合生理、低毒和高效等优点成为重要的肿瘤辅助治疗手段。其中，细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-inducedkillercells，CIK细胞)是近年来发现的一种非常有前景的过继免疫细胞，具有增殖迅速、杀瘤活性广谱且高效、毒副作用微小等优点，已经成为肿瘤免疫治疗领域的一种新选择。CIK是以CD3+CD56+T细胞为主的异质细胞群，兼有NK细胞和T细胞的特征。在功能上，CIK一方面拥有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，另一方面还拥有NK细胞非MHC限制性的杀伤肿瘤的特点，其增殖迅速、对正常造血影响轻微。CIK细胞的增殖和细胞毒活性依赖于多种外源性细胞因子的刺激，但何种因子组合为最佳尚无定论，因此研究如何进一步提高CIK的增殖和杀瘤活性已经成为抗肿瘤的过继免疫细胞生物治疗的一个热点(参考文献：黄招琴等，卡介菌多糖核酸对CIK细胞活性的影响，湖南师范大学自然科学学报，2017年3月第40卷第2期)。颗粒酶B是杀伤性T淋巴细胞和NK细胞颗粒中最重要的丝氨酸蛋白酶，通过Caspases依赖途径、直接入核途径及不依赖Caspases的胞质途径杀伤靶细胞，颗粒酶B的表达水平直接关系到CIK细胞对肿瘤的杀伤力(参考文献：PrakashMD,BirdCH,BirdPI.ActiveandzymogenformsofgranzymeBareconstitutivelyreleasedfromcytotoxiclymphocytesintheabsenceoftargetcellengagement,ImmunolCellBiol.2009)。因此，如果能寻找到促进CIK细胞颗粒酶B表达水平的诱导化合物，就可以用于CIK细胞培养提高CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤力。表原莪术烯醇(CAS登录号127214-97-5)、莪术烯醇(CAS登录号19431-84-6)、苦蘵内酯A(CAS登录号146713-98-6)、苦蘵内酯F和魏察苦蘵素A(CAS登录号120824-03-5)的化学信息如图1所示。目前没有现有技术道过表原莪术烯醇、莪术烯醇、苦蘵内酯A、苦蘵内酯F和魏察苦蘵素A可以存进CIK细胞颗粒酶B的表达。另外，目前制备表原莪术烯醇、莪术烯醇、苦蘵内酯A、苦蘵内酯F、魏察苦蘵素A的方法步骤复杂，依赖于反复柱层析，不适用于规模化制备。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种CIK细胞的培养方法。本专利技术通过下面的技术方案得以实现的：一种CIK细胞的培养方法，包括：取外周抗凝血100mL，加入淋巴细胞分离液，1500rpm离心15min，吸取单个核细胞层，用生理盐水洗涤3次，每次1500rpm离心10min；最后一次离心后重悬细胞，按细胞数5×106个/mL加含有500μg/LCD3mAB、1000U/mLIL-2和10％FBS的GT-T551培养基诱导培养成CIK细胞，每隔2～3d半量换液。诱导培养7天后，用新的含有500μg/LCD3mAB、1000U/mLIL-2和10％FBS的GT-T551培养基调整细胞数为2×106/ml，并加入颗粒酶B激活剂至终浓度为4-6μM，刺激培养2d后，换成含有500μg/LCD3mAB、1000U/mLIL-2和10％FBS的GT-T551培养基继续培养，每隔2～3d半量换液。所述颗粒酶B激活剂为表原莪术烯醇。进一步地，外周抗凝血取自健康人或肿瘤患者。进一步地，颗粒酶B激活剂终浓度为5μM。一种CIK细胞的培养方法，包括：取外周抗凝血100mL，加入淋巴细胞分离液，1500rpm离心15min，吸取单个核细胞层，用生理盐水洗涤3次，每次1500rpm离心10min；最后一次离心后重悬细胞，按细胞数5×106个/mL加含有500μg/LCD3mAB、1000U/mLIL-2和10％FBS的GT-T551培养基诱导培养成CIK细胞，每隔2～3d半量换液。诱导培养7天后，用新的含有500μg/LCD3mAB、1000U/mLIL-2和10％FBS的GT-T551培养基调整细胞数为2×106/ml，并加入颗粒酶B激活剂至终浓度为4-6μM，刺激培养2d后，换成含有500μg/LCD3mAB、1000U/mLIL-2和10％FBS的GT-T551培养基继续培养，每隔2～3d半量换液。所述颗粒酶B激活剂为莪术烯醇。进一步地，外周抗凝血取自健康人或肿瘤患者。进一步地，颗粒酶B激活剂终浓度为5μM。一种CIK细胞的培养方法，包括：取外周抗凝血100mL，加入淋巴细胞分离液，1500rpm离心15min，吸取单个核细胞层，用生理盐水洗涤3次，每次1500rpm离心10min；最后一次离心后重悬细胞，按细胞数5×106个/mL加含有500μg/LCD3mAB、1000U/mLIL-2和10％FBS的GT-T551培养基诱导培养成CIK细胞，每隔2～3d半量换液。诱导培养7天后，用新的含有500μg/LCD3mAB、1000U/mLIL-2和10％FBS的GT-T551培养基调整细胞数为2×106/ml，并加入颗粒酶B激活剂至终浓度为4-6μM，刺激培养2d后，换成含有500μg/LCD3mAB、1000U/mLIL-2和10％FBS的GT-T551培养基继续培养，每隔2～3d半量换液。所述颗粒酶B激活剂为苦蘵内酯A。进一步地，外周抗凝血取自健康人或肿瘤患者。进一步地，颗粒酶B激活剂终浓度为5μM。一种CIK细胞的培养方法，包括：取外周抗凝血100mL，加入淋巴细胞分离液，1500rpm离心15min，吸取单个核细胞层，用生理盐水洗涤3次，每次1500rpm离心10min；最后一次离心后重悬细胞，按细胞数5×106个/mL加含有500μg/LCD3mAB、1000U/mLIL-2和10％FBS的GT-T551培养基诱导培养成CIK细胞，每隔2～3d半量换液。诱导培养7天后，用新的含有500μg/LCD3mAB、1000U/mLIL-2和10％FBS的GT-T551培养基调整细胞数为2×106/ml，并加入颗粒酶B激活剂至终浓度为4-6μM，刺激培养2d后，换成含有500μg/LCD3mAB、1000U/mLIL-2和10％FBS的GT-T551培养基继续培养，每隔2～3d半量换液。所述颗粒酶B激活剂为苦蘵内酯F。进一步地，外周抗凝血取自健康人或肿瘤患者。进一步地，颗粒酶B激活剂终浓度为5μM。一种CIK细胞的培养方法，包括：取外周抗凝血100mL，加入淋巴细胞分离液，1500rpm离心15min，吸取单个核细胞层，用生理盐水洗涤3次，每次1500rpm离心10min；最后一次离心后重悬细胞，按细胞数5×106个/mL加含有500μg/LCD3mAB、1000U/mLIL-2和10％FBS的GT-T551培养基诱导培养成CIK细胞，每隔2～3d半量换液。诱导培养7天后，用新的含有500μg/LCD3mAB、1000U/mLIL-2和10％FBS的GT-T551培养基调整细胞数为2×1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种魏察苦蘵素A，其特征在于，化学结构式如下：

【技术特征摘要】
1.一种魏察苦蘵素A，其特征在于，化学结构式如下：2.权利要求1所述魏察苦蘵素A的制备方法，其特征在于包括：步骤S1，粗品的制备：将苦蘵干燥全草粉碎后，过40目筛，取1kg用5L体积百分浓度为70％的乙醇水溶液热回流提取120min，提取2次，合并滤液减压浓缩至无醇味，上样于BS-75大孔吸附树脂柱(90cm×3.5cm，树脂550mL)，先用5倍柱床体积的30％乙醇洗脱，再用6倍柱床体积的70％乙醇洗脱，收集第5-6倍柱床体积的70％乙醇洗脱液，减压浓缩得粗品，备用。步骤S2，高速逆流制备分离过程：配制两相溶剂体系(正丁醇/甲醇/乙酸/水＝6/2/1/5)，充分振摇后静置，使用前分开上下相，超声脱气后...

【专利技术属性】
技术研发人员：王欢，
申请(专利权)人：王欢，
类型：发明
国别省市：江苏,32