血清中蔗糖测定方法技术

本发明专利技术公开了一种血清中蔗糖测定方法，属于利用可见光，通过测试反应的结果产生颜色变化来测试材料的方法。本发明专利技术的技术方案是：工具酶及指示酶同在试剂I中，试剂II仅有蔗糖酶有效成分；其测定方法为：血清中葡萄糖先与试剂Ⅰ于37℃温浴3～5分钟，血清中葡萄糖与试剂Ⅰ反应生成醌亚胺，加入试剂Ⅱ后于37℃温浴4～7分钟，蔗糖在蔗糖酶的作用下水解生成α‑D‑葡萄糖和β‑D‑果糖，水解生成的α‑D‑葡萄糖与试剂Ⅰ反应产生醌亚胺。仪器在540nm波长处检测，以试剂Ⅰ反应产生的醌亚胺为空白，由试剂Ⅱ反应产生的醌亚胺计算出蔗糖的含量。本发明专利技术检测时不受内源性葡萄糖影响，其方法经济方便易行，不需要特殊检测设备，是一种准确性更高的蔗糖检测方法。

【技术实现步骤摘要】
血清中蔗糖测定方法
本专利技术属于一种包含酶的测定方法；或是利用可见光，通过测试反应的结果产生颜色变化来测试材料的方法，特别是涉及一种用生化分析仪快捷、准确检测血清中蔗糖的测定方法。
技术介绍
蔗糖最主要的功效就是为人类身体补充能量，它进入人体以后很容易被吸收和利用，能很快转化成能量，从而也就减少了疲劳症状的发生，蔗糖味甜，对人类身体有多种好处，但是它在食用时却有一些禁忌，最重要的一点就是那些患有高血溏和糖尿病的人群不能食用，不然会让身体的血糖指数快速升高，对病情控制不利，会严重伤害人们的身体健康。蔗糖在人体消息化系统内经过消化液分解产生等量的α-D-葡萄糖和β-D-果糖。纯净的蔗糖是无色晶体易溶于水，比葡萄糖、麦芽糖甜，但不如果糖甜。蔗糖是由一分子葡萄糖和一分子果糖缩合失去一分子水而成，葡萄糖分子中的醛基和果糖分子中的酮基都被破坏，因此没有还原性，属非还原性二糖。蔗糖在酸或蔗糖酶的作用下，水解生成等量的葡萄糖和果糖。葡萄糖、果糖、蔗糖它们的区别在于：1、葡萄糖(是一种六碳一元醛糖，水溶液中存在缩合平衡：大部分分子内醛基和5-羟基发生缩合形成吡喃糖，含苷羟基)分子中含有醛基(-CHO)或苷羟基，具有还原作用，是最典型的还原性糖。2、果糖(是一种六碳一元酮糖，水溶液中存在缩合平衡：部分分子内酮基和4-羟基发生缩合形成呋喃糖，不含醛基或苷羟基)分子中虽然不含有上述基团，但在水溶液非酸性环境下存在平衡能部分转化为醛糖(甘露糖/葡萄糖)和醛(甲醛；副产物二羟基丙酮,是最简单的酮糖,非还原性糖)，转化产物中含醛基,所以果糖也是还原性糖。3、一分子蔗糖(α-D-葡萄吡喃苷基-β-D-呋喃果糖苷)由一分子β-D-呋喃果糖和一分子α-D-吡喃葡萄糖缩合(脱1分子H2O)形成，其中不含醛基或苷羟基，因此不是还原糖。蔗糖是由α-D-葡萄糖和β-D-果糖以α-1，2糖苷键构成，其水解方程式为：葡萄糖与果糖互为同分异构体，葡萄糖是一种多羟基醛(醛糖)，果糖是一种多羟基酮(酮糖)，果糖分子中并无醛基存在，它们的结构式及反应产物如图1所示。葡萄糖米氏常数为1.5×10-2M，分子量342.3。无色晶体，具有旋光性，但无变旋。蔗糖的分子式：C12H22O11。蔗糖容易被酸水解，水解后产生等量的α-D-葡萄糖和β-D-果糖。易溶于水较难溶于乙醇。目前国内临床实验室尚无测定血清中蔗糖浓度方法，本专利技术测定方法包括以下几个基本反应步骤：人体血清中葡萄糖与试剂Ⅰ中在葡萄糖氧化酶和过氧化物酶(POD)的催化下生成H2O2，H2O2与4-氨基安替比林(4-AAP)和2，4-二氯酚(也可使用4-氯酚、苯酚衍生物、苯胺盐和苯磺酸盐，下面就以2，4-二氯酚为代表叙述，其他色原不再重复提起，)形成有色染料醌亚胺,加入试剂Ⅱ后于37℃温浴3～6分钟，蔗糖在试剂Ⅱ中蔗糖酶的作用下，水解为α-D-葡萄糖和β-D-果糖，α-D-葡萄糖在变旋酶的作用下转变为β-D-葡萄糖糖，β-D-葡萄糖糖再循环第一步反应也生成醌亚胺，仪器在505～550nm波长处检测，以试剂Ⅰ反应产生的红色醌亚胺为空白，由试剂Ⅱ反应产生的红色醌亚胺计算出蔗糖的含量。第二步反应生成醌亚胺的量与样本中蔗糖的含量成正比。最后通过分光光度法计算出相应的蔗糖浓度，具体反应见化学反应式1～6。本专利技术方法蔗糖测定反应公式：第一步反应第二步反应
技术实现思路
：生化分析仪检测血清中蔗糖采用酶法，人体血清中葡萄糖与试剂Ⅰ中在葡萄糖氧化酶和过氧化物酶(POD)的催化下生成H2O2，H2O2与4-氨基安替比林(4-AAP)和2，4-二氯酚(也可使用4-氯酚、苯酚衍生物、苯胺盐和苯磺酸盐，下面就以2，4-二氯酚为代表叙述，其他色原不再重复提起，)形成有色染料醌亚胺,加入试剂Ⅱ后于37℃温浴3～6分钟，蔗糖在试剂Ⅱ中蔗糖酶的作用下，水解为α-D-葡萄糖和β-D-果糖，α-D-葡萄糖在变旋酶的作用下转变为β-D-葡萄糖糖，β-D-葡萄糖糖再循环第一步反应也生成醌亚胺，仪器在505～550nm波长处检测，以试剂Ⅰ反应产生的红色醌亚胺为空白，由试剂Ⅱ反应产生的红色醌亚胺计算出蔗糖的含量。第二步反应生成醌亚胺的量与样本中蔗糖的含量成正比。本专利技术方法测定蔗糖不受血清中葡萄糖含量的影响，通过内空白法消除了血清中的葡萄糖的干扰，为真正的蔗糖含量。本专利技术的技术方案是：工具酶及指示酶同在试剂I中，试剂II仅有蔗糖酶有效成分；其测定方法为：血清中葡萄糖先与试剂Ⅰ于37℃温浴3～6分钟，血清中葡萄糖与试剂Ⅰ反应生成红色醌亚胺，加入试剂Ⅱ后于37℃温浴3～6分钟，在蔗糖酶水解作用下蔗糖分解为α-D-葡萄糖和β-D-果糖，α-D-葡萄糖在变旋酶的作用下转变为β-D-葡萄糖糖，β-D-葡萄糖糖再循环第一步反应也生成醌亚胺，仪器在505～550nm波长处检测，以试剂Ⅰ反应产生的红色醌亚胺为空白，由试剂Ⅱ反应产生的红色醌亚胺计算出蔗糖的含量。试剂I：0.1mol/LpH7.5磷酸盐缓冲液中含有葡萄糖氧化酶(GOD)15KU/L，过氧化物酶(POD)15KU/L，2，4-二氯酚4.0mmol/L，4-氨基安替比林1.60mmol/L，抗坏血酸氧化酶30KU/L，变旋酶2KU/L，Proclin-300200μL/L。试剂II：0.1mol/LpH7.5磷酸盐缓冲液中含有蔗糖酶4.0KU/L，Proclin-300200μL/L。上试剂Ⅰ和试剂Ⅱ中磷酸盐缓冲液的pH值为7.5±0.2。上述测定中反应物的体积比为：样品∶试剂I∶试剂II＝1∶60～90∶20～30。本专利技术方法采用内空白法测定血清中蔗糖浓度，血清中葡萄糖在葡萄糖过氧化物酶、过氧化物酶的作用下与2，4-二氯酚，4-氨基安替比林反应生成醌亚胺，当加入试剂II后，蔗糖水解生成葡萄糖，在葡萄糖过氧化物酶、过氧化物酶的作用下与2，4-二氯酚，4-氨基安替比林生成醌亚胺，仪器以第一步反应生成的醌亚胺为空白，以第二步反应生成的醌亚胺计算出蔗糖的含量。本专利技术可以测得血液、乳汁、尿液及体液中的蔗糖含量，测定线性范围可达18.9mmol/L。不会增加实验人员的负担，不增加试剂成本，经济方便易行，是一种准确性更高的蔗糖检测方法。附图说明附图1是蔗糖水解生成α-D-葡萄糖和β-D-果糖反应的产物结构示意图。附图2是本专利技术测定人体血清中蔗糖的实时反应曲线图。具体实施方式：下面通过实施例及附图对本专利技术做进一步详细说明。实施例1试剂的组成：a.试剂Ⅰ：试剂I：0.1mol/LpH7.5磷酸盐缓冲液中含有葡萄糖氧化酶(GOD)15KU/L，过氧化物酶(POD)15KU/L，2，4-二氯酚4.0mmol/L，4-氨基安替比林1.60mmol/L，抗坏血酸氧化酶30KU/L，变旋酶2KU/L，Proclin-300200μL/L。b.试剂Ⅱ：试剂II：0.1mol/LpH7.5磷酸盐缓冲液中含有蔗糖酶4.0KU/L，Proclin-300200μL/L。c.标准液：5.55mmol/L葡萄糖水溶液。其中，Proclin-300为液体高效防腐剂。实施例2.试剂Ⅰ中将2，4-二氯酚改为4-氯酚，含量不变，其他成分都不变，试剂Ⅱ不变。实施例3测定程序双试剂法：在日本OLYMPUSAU2700全自动化生化分析仪上，仪器自动将3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种血清中蔗糖测定方法，其特征在于：工具酶及指示酶同在试剂I中，试剂II中仅有蔗糖酶有效成分；其测定方法为：血清中葡萄糖先与试剂Ⅰ于37℃温浴3～5分钟，血清中葡萄糖与试剂Ⅰ反应生成醌亚胺，加入试剂Ⅱ后于37℃温浴4～7分钟，蔗糖在蔗糖酶的作用下水解生成α‑D‑葡萄糖和β‑D‑果糖，水解生成的α‑D‑葡萄糖与试剂Ⅰ反应产生醌亚胺，仪器在540nm波长处检测，以试剂Ⅰ反应产生的醌亚胺为空白，由试剂Ⅱ反应产生的醌亚胺计算出蔗糖的含量。计算公式为：反应OD蔗糖＝OD2—OD1×[(SV+R1V1)/(SV+R1V1+R2V2)]蔗糖浓度＝F×OD蔗糖其中OD蔗糖是蔗糖产生的吸光度。OD1是样品加入试剂Ⅰ反应后测得的吸光度，OD2蔗糖是加入试剂Ⅱ反应后测得的吸光度，SV是样品的体积，R1V1是试剂Ⅰ的体积，R2V2是试剂Ⅱ的体积。F是校正因数。加入试剂II后OD1的稀释倍数为[(SV+R1V1)/(SV+R1V1+R2V2)]，加入试剂II后的吸光度即为OD1×[(SV+R1V1)/(SV+R1V1+R2V2)]。所以，由蔗糖产生的醌亚胺的吸光度为：OD蔗糖＝OD2‑OD1×[(SV+R1V1)/(SV+R1V1+R2V2)]，即OD蔗糖＝OD2–(3+225)/(3+225+75)×OD1。只要测出OD1和OD2即可计算出蔗糖的浓度。...

【技术特征摘要】
1.一种血清中蔗糖测定方法，其特征在于：工具酶及指示酶同在试剂I中，试剂II中仅有蔗糖酶有效成分；其测定方法为：血清中葡萄糖先与试剂Ⅰ于37℃温浴3～5分钟，血清中葡萄糖与试剂Ⅰ反应生成醌亚胺，加入试剂Ⅱ后于37℃温浴4～7分钟，蔗糖在蔗糖酶的作用下水解生成α-D-葡萄糖和β-D-果糖，水解生成的α-D-葡萄糖与试剂Ⅰ反应产生醌亚胺，仪器在540nm波长处检测，以试剂Ⅰ反应产生的醌亚胺为空白，由试剂Ⅱ反应产生的醌亚胺计算出蔗糖的含量。计算公式为：反应OD蔗糖＝OD2—OD1×[(SV+R1V1)/(SV+R1V1+R2V2)]蔗糖浓度＝F×OD蔗糖其中OD蔗糖是蔗糖产生的吸光度。OD1是样品加入试剂Ⅰ反应后测得的吸光度，OD2蔗糖是加入试剂Ⅱ反应后测得的吸光度，SV是样品的体积，R1V1是试剂Ⅰ的体积，R2V2是试剂Ⅱ的体积。F是校正因数。加入试剂II后OD1的稀释倍数为[(SV+R1V1)/(SV+R1V1+R2V2)]，加入试剂II后的吸光度即为OD1×[(SV+R1V1)/(SV+R1V1+R2V2)]。所以，由蔗糖产生的醌亚胺的吸光度为：OD蔗糖＝OD2-OD1×[(SV+R1V1)/(SV+R1V1+R2V2)]，即OD蔗糖＝OD2–(...

【专利技术属性】
技术研发人员：李立和，孙国忠，杨朕，
申请(专利权)人：天津市宝坻区人民医院，
类型：发明
国别省市：天津,12