一种植物鲜叶可溶性糖快速微量测定方法技术

本发明专利技术涉及植物生物技术领域，具体是一种改良的植物鲜叶可溶性糖快速微量测定方法，直接微量取样，简单提取后采用酶标板快速测定方法，适合于针对大批量材料采用高通量的筛选。本发明专利技术优点在于：本发明专利技术的方法，不需要烘干过程，采用液氮速冻后研磨粉碎，大大节约了样品处理时间；本发明专利技术建立了一套优化的微量离心管处理样品、酶标板测定的微量测定体系，大大节省了蒽酮、浓硫酸等化学试剂的用量，该方法可以配合移液工作站使用，实现高通量检测方法；本发明专利技术建立了一套基于植物新鲜组织微量样品的测定方法，为植物活体叶片中可溶性糖含量的时空分布规律研究提供了简便有效的评估手段，为植物的耐逆性研究和品质改良提供有用线索。

【技术实现步骤摘要】
一种植物鲜叶可溶性糖快速微量测定方法
本专利技术涉及植物生物
，具体地说，是一种改良的植物鲜叶可溶性糖快速微量测定方法。
技术介绍
糖是植物体内一类重要有机物，对植物生长发育与形态建成具有重要作用。糖不仅作为呼吸底物为植物的生长发育提供能量，而且还作为代谢中间产物合成植物细胞结构物质的碳架等。同时糖还植物体内重要的信号分子，对基因的表达也起到调控作用。可溶性糖指易溶于水的糖，常见的如葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖等。可溶性糖是植物体内重要的渗透调节物质，与植物的抗逆性(如抗旱性、抗寒性等)密切相关。同时，可溶性糖还影响到植物食用组织或器官的品质与口感。因此，植物组织中可溶性糖含量测定是一项常规测定指标，建立快速准确的检测方法对于科研和生产具有重要意义。蒽酮硫酸比色法是测定植物组织可溶性糖含量的常用方法，其原理是糖在浓硫酸作用下，脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛与蒽酮反应，生成蓝绿色化合物，在一定的范围内，颜色深浅与糖的含量成正比。蒽酮法测定可溶性糖因其准确性高、重现性好、操作简便、快速、灵敏等优点而被广泛应用于各种植物组织中可溶性糖含量的测定。尽管一些文献报道对蒽酮比色法测定可溶性糖的方法进行了优化(参考文献：丁雪梅,张晓君,赵云,等.蒽酮比色法测定可溶性糖含量的试验方法改进[J].黑龙江畜牧兽医,2014(23):230-233；位杰,吴翠云,蒋媛,等.蒽酮法测定红枣可溶性糖含量条件的优化[J].食品科学,2014,35(24):136-140；)，但在实际应用中仍然存在一些需要改进之处，如样品需要烘干测定，粉碎和提取反应时间较长，反应试剂用量较多，采用常规比色皿测定需要样品体积较多、一次测定样品数目非常有限等问题，急需建立一种针对植物鲜叶的，优化样品处理流程，快速微量测定植物中的可溶性糖含量的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的上述缺陷，提供一种针对植物新鲜叶片，直接微量取样，简单提取后采用酶标板快速测定方法，适合于针对大批量材料采用高通量的筛选。本专利技术的第一方面，提供一种快速微量测定植物新鲜叶片中可溶性糖含量的方法，包括以下步骤：A)取植物新鲜叶片10-100mg，装入离心管中；B)向离心管中加入少许液氮，用研磨棒迅速研磨成粉；C)待液氮挥干，加入1.0ml超纯水，混匀；D)放入沸水浴(100℃)加热10min；E)取出离心管，10000rpm离心3min；F)吸取上清溶液50μl到另一离心管中；G)依次加入450μl超纯水，蒽酮(20mg/ml)100μl和浓硫酸(1.84g/cm3)1000μl，混匀；H)放入沸水浴(100℃)加热；I)取出离心管，冷却10min；J)取显色液采用酶标仪，在620nm波长下测定其吸光度(A)；K)取葡萄糖标准溶液，采用步骤G-J，进行显色反应，测定吸光度(A)，以吸光度A为纵坐标，以糖含量C为横坐标，绘制标准曲线，并求出标准线性方程和相关系数R；L)由标准线性方程求出测定糖量(μg)，按下式计算原样品中的可溶性糖含量：进一步的，所述的方法适用于大多数植物，优选自大麦、小麦、水稻、玉米、拟南芥、油菜等作物以及枸杞、石斛等药用植物等，测定材料选用新鲜叶片。进一步的，所述的植物新鲜叶片一般优选倒二叶或倒三叶叶尖部分；更优选倒三叶顶部。进一步的，所述的步骤A和步骤F中离心管为2.0ml微量离心管。进一步的，所述的步骤H中加热时间为7min。进一步的，所述的步骤I中放在湿冰上冷却。进一步的，所述的步骤K的具体步骤为：称取干燥后葡萄糖标准品溶于超纯水，配制500μg/ml标准品母液，吸取相应体积母液配制10-200μg的总体积为500μl的不同浓度的葡萄糖标准溶液，同上步骤G-J，加入蒽酮(20mg/ml)100μl和浓硫酸(1.84g/cm3)1000μl，进行显色反应，测定吸光度(A)，以吸光度A为纵坐标，以糖含量C为横坐标，绘制标准曲线，并求出标准线性方程和相关系数R(R至少含2个9)。在本专利技术的一个优选实施方式中，本专利技术的一种快速微量测定植物新鲜叶片中可溶性糖含量的方法，包括以下步骤：A)剪取植物叶片(一般优选倒二叶或倒三叶叶尖部分)，称量10-100mg，装入2.0ml离心管中；B)向离心管中加入少许液氮，用研磨棒迅速研磨成粉；C)待液氮挥干，加入1.0ml超纯水，混匀；D)放入沸水浴(100℃)加热10min；E)取出离心管，10000rpm离心3min；F)小心吸取上清溶液50μl到另一干净的2.0ml离心管中；G)依次加入450μl超纯水，蒽酮(20mg/ml)100μl和浓硫酸(1.84g/cm3)1000μl，混匀；H)放入沸水浴(100℃)加热7min；I)取出离心管，放在湿冰上冷却10min；J)取100μl显色液置于96孔透明板中，采用酶标仪，在620nm波长下测定其吸光度(A)；K)称取干燥后葡萄糖标准品溶于超纯水，配制500μg/ml标准品母液，吸取相应体积母液配制10-200μg的总体积为500μl的不同浓度的葡萄糖标准溶液，同上步骤G-J，加入蒽酮(20mg/ml)100μl和浓硫酸(1.84g/cm3)1000μl，进行显色反应，测定吸光度(A)，以吸光度A为纵坐标，以糖含量C为横坐标，绘制标准曲线，并求出标准线性方程和相关系数R(R至少含2个9)；L)由标准线性方程求出测定糖量(μg)，按下式计算原样品中的可溶性糖含量：本专利技术优点和有益效果在于：1、本专利技术提供了一种适合大麦等植物新鲜叶片组织可溶性糖含量的快速测定方法，不需要烘干过程，采用液氮速冻后研磨粉碎，大大节约了样品处理时间；2、本专利技术建立了一套优化的微量离心管处理样品、酶标板测定的微量测定体系，大大节省了蒽酮、浓硫酸等化学试剂的用量，该方法可以配合移液工作站使用，实现高通量检测方法；3、本专利技术建立了一套基于植物新鲜组织微量样品的测定方法，为植物活体叶片中可溶性糖含量的时空分布规律研究提供了简便有效的评估手段，为植物的耐逆性研究和品质改良提供有用线索。附图说明图1不同显色反应温度对葡萄糖标液(200μg)测定吸光度的影响；图2不同显色反应时间对葡萄糖标液(200μg)测定吸光度的影响；图3大麦鲜叶和干粉(约100mg)不同提取时间测定可溶性糖含量比较；图4葡萄糖标准溶液系列浓度测定线性范围与计算线性方程；图5大麦幼苗(4-5叶期)分叶片部位取样示意图；图6大麦幼苗不同部位取样测定可溶性糖含量结果。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术提供的具体实施方式作详细说明。实施例1本专利技术的一种改良经典蒽酮-硫酸比色法快速微量测定植物新鲜叶片中可溶性糖含量的方法，包括以下步骤：A)剪取植物叶片(一般优选倒二叶或倒三叶叶尖部分)，称量10-100mg，装入2.0ml离心管中；B)向离心管中加入少许液氮，用研磨棒迅速研磨成粉；C)待液氮挥干，加入1.0ml超纯水，混匀D)放入沸水浴(100℃)加热10minE)取出离心管，10000rpm离心3minF)小心吸取上清溶液50μl到另一干净的2.0ml离心管中G)依次加入450μl超纯水，蒽酮(20mg/ml)100μl和浓硫酸(1.84g/cm3)1000μl，混匀H)放入沸水浴(100℃)加热7minI)取出离心管，放在湿冰上本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速微量测定植物新鲜叶片中可溶性糖含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：A)取植物新鲜叶片10‑100mg，装入离心管中；B)向离心管中加入少许液氮，用研磨棒迅速研磨成粉；C)待液氮挥干，加入1.0ml超纯水，混匀；D)放入100℃沸水浴加热10min；E)取出离心管，10000rpm离心3min；F)吸取上清溶液50μl到另一离心管中；G)依次加入450μl超纯水，20mg/ml的蒽酮100μl和1.84g/cm3的浓硫酸1000μl，混匀；H)放入100℃沸水浴加热；I)取出离心管，冷却10min；J)取显色液采用酶标仪，在620nm波长下测定其吸光度；K)取葡萄糖标准溶液，采用步骤G‑J，进行显色反应，测定吸光度，以吸光度为纵坐标，以糖含量为横坐标，绘制标准曲线，并求出标准线性方程和相关系数R；L)由标准线性方程求出测定糖量，按下式计算原样品中的可溶性糖含量：

【技术特征摘要】
1.一种快速微量测定植物新鲜叶片中可溶性糖含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：A)取植物新鲜叶片10-100mg，装入离心管中；B)向离心管中加入少许液氮，用研磨棒迅速研磨成粉；C)待液氮挥干，加入1.0ml超纯水，混匀；D)放入100℃沸水浴加热10min；E)取出离心管，10000rpm离心3min；F)吸取上清溶液50μl到另一离心管中；G)依次加入450μl超纯水，20mg/ml的蒽酮100μl和1.84g/cm3的浓硫酸1000μl，混匀；H)放入100℃沸水浴加热；I)取出离心管，冷却10min；J)取显色液采用酶标仪，在620nm波长下测定其吸光度；K)取葡萄糖标准溶液，采用步骤G-J，进行显色反应，测定吸光度，以吸光度为纵坐标，以糖含量为横坐标，绘制标准曲线，并求出标准线性方程和相关系数R；L)由标准线性方程求出测定糖量，按下式计算原样品中的可溶性糖含量：2.根据权利要求1所述的快速微量测定植物新鲜叶片中可溶性糖含量的方法，其特征在于，所述的植物选自大麦、小麦、水稻、玉米、拟南芥、油菜、枸杞、石斛，测定材料选用新鲜叶片。3.根据权利要求1所述的快速微量测定植物新鲜叶片中可溶性糖含量的方法，其特征在于，所述的植物新鲜叶片选择倒二叶或倒三叶叶尖部分。4.根据权利要求1所述的快速微量测定植物新鲜叶片中可溶性糖含量的方法，其特征在于，所述的步骤A和步骤F中离心管为2.0ml微量离心管。5.根据权利要求1所述的快速微量测定植物新鲜叶片中可溶性糖含量的方法，其特征在于，所述的步骤H中加热时间为7min。6.根据权利要求1所述的快速微量测定植物新鲜叶片中可溶性糖含量的方法，其特征在于，所述的步骤I中放在湿冰上冷却。7.根据权利要求1所述的快速微量测定植物新鲜叶片中可溶性糖含量的方法，其特征在于，所述的步骤K的具体步骤为...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘成洪，宗营杰，张述伟，郭桂梅，何婷，陆瑞菊，黄剑华，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：上海,31