一种基于单粒径并可同时检测血清和尿液样本中视黄醇结合蛋白的试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种基于单粒径并可同时检测血清和尿液样本中视黄醇结合蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括试剂R1、试剂R2和校准品A、校准品B，所述试剂R2包括乳胶‑多克隆抗体交联物和试剂R2缓冲液，所述乳胶‑多克隆抗体交联物占所述试剂R2的质量百分比为0.05～1.0％，所述试剂R2缓冲液组分为：50～120mM Hepes缓冲液、0.1％Proclin 300、1～5％蔗糖、1～5％NaCl、0.1～1％曲拉通，其余为纯化水，pH为6.5～8.5。本发明专利技术所述试剂盒具有血尿同测、操作简单、灵敏度高、线性范围宽、成本低(不仅体现在仅适用一种粒径和多克隆抗体就能满足检测要求，还体现在制备乳胶‑多克隆抗体时仅离心一次就能满足标记需求)且利于市场推广的优点。同时该检测试剂盒兼容市场上大多数生化检测设备，可直接进入市场。

【技术实现步骤摘要】
一种基于单粒径并可同时检测血清和尿液样本中视黄醇结合蛋白的试剂盒
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种基于单粒径并可同时检测血清和尿液样本中视黄醇结合蛋白的试剂盒。
技术介绍
视黄醇结合蛋白(RetinolBindingProtcin,RBP)为血液中视黄醇(维生素A)的转运蛋白。RBP主要由肝细胞合成，广泛分布于人体血清、脑脊液、尿液及其他体液中。在血液中，RBP与视黄醇、前白蛋白以1:1:1(mol)的复合物形式存在，转运体内90％的视黄醇至机体组织，当RBP与细胞表面的RBP受体结合时，视黄醇进入细胞内，复合物解体，游离的RBP从肾小球滤出，其中绝大部分被近端肾小管上皮细胞重吸收，并被分解。研究表明，视黄醇结合蛋白在高血压及糖尿病早期肾病的诊断中具有重要意义，可作为临床诊断高血压及糖尿病早期肾病的参考指标进行临床检测：(1)与肝病的关系：肝病患者血清中RBP显著低于正常人，且急性病毒性肝炎病程早期血清RBP含量降低较晚期更明显。血清RBP水平能准确、灵敏地反映肝功能变化；(2)与肾脏病的关系：RBP稳定性好，是一个比β2-MG更实用、可靠的肾功能指标，当肾小管功能受损时，尿中RBP可明显增高，较肌酐、尿素更准确灵敏；(3)与其它疾病关系：RBP水平是反映营养性疾病疗效的灵敏、特异性指标，甲亢患者RBP水平较正常人低，甲减患者RBP水平高于正常人。此外，当血清RBP低于正常一半时，患者才出现暗适应能力降低，提示血清RBP含量能更灵敏地反映维生素A缺乏症。临床上广泛使用的RBP检测方法有酶联免疫吸附EIA、单向免疫扩散RID、免疫比浊等。酶联免疫吸附法的检测限较差，并且费时。单向免疫扩散主要是手工操作，试验重复性较差，检测的准确度不高，临床已经不再采用其为定量检测方法。目前临床进行大量样本检测常采用的方法是免疫比浊法，但由于信号低，即灵敏度低无法达到目前市场上要求的血尿同检。目前市场上有采用胶乳增强免疫比浊法测定RBP，基于双粒径的胶乳增强免疫比浊法、基于双单克隆抗体抗体胶乳增强免疫比浊法、基于一种单克隆抗体和一种多克隆抗体的胶乳增强免疫比浊法，虽然灵敏度足够高可以做到血尿同检，但由于试剂生产成本高，不利于市场推广。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是解决目前市场上检测灵敏度低(只能检测血清中RBP)或生产成本高(能同时检测血清和尿液中的RBP，但是基于双粒径的技术方案生产成本较高)的技术缺陷，提供一种基于单粒径并可同时检测血清和尿液样本中视黄醇结合蛋白的试剂盒。本专利技术所述试剂盒不仅提高了试剂灵敏度，还大大提高了测量范围，可以同时检测血液与尿液样本中的视黄醇结合蛋白含量，同时兼容市场上大多数生化检测设备，可直接进入市场。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术手段为：一种基于单粒径并可同时检测血清和尿液样本中视黄醇结合蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括试剂R1、试剂R2和校准品A、校准品B，其中：所述试剂R1组分为：50～120mMHepes缓冲液、0.1％Proclin300、1～5％NaCl、0.1～1％曲拉通，其余为纯化水，pH6.5～8.5；所述试剂R2包括乳胶-多克隆抗体交联物和试剂R2缓冲液，所述乳胶-多克隆抗体交联物占所述试剂R2的质量百分比为0.05～1.0％，所述试剂R2缓冲液组分为：50～120mMHepes缓冲液、0.1％Proclin300、1～5％蔗糖、1～5％NaCl、0.1～1％曲拉通，其余为纯化水，pH为6.5～8.5；所述乳胶-多克隆抗体交联物采用胶乳颗粒和多克隆抗体制备得到；所述胶乳颗粒为粒径为80～200nm的聚苯乙烯胶乳；所述多克隆抗体与所述乳胶颗粒的比例为25～100μg:1mg；所述试剂R2是含有乳胶-多克隆抗体交联物的缓冲液；所述校准品A包括校准品A稀释液和视黄醇结合蛋白；所述校准品A稀释液组分为：50～150mMHepes缓冲液、0.1％Proclin300、1～5％蔗糖、1～5％NaCl、0.1～1％曲拉通，其余为纯化水，pH为6.5～8.5；所述视黄醇结合蛋白的浓度梯度为140.00、70.00、35.00、15.00、5.00、0.00mg/L；所述校准品B包括校准品B稀释液和视黄醇结合蛋白；所述校准品B稀释液组分为：50～150mMHepes缓冲液、0.1％Proclin300、1～5％蔗糖、1～5％NaCl、0.1～1％曲拉通，其余为纯化水，pH为6.5～8.5；所述视黄醇结合蛋白的浓度梯度为20.00、10.00、5.00、2.50、1.00、0.00mg/L。优选地，所述试剂R1组分为：80mMHepes缓冲液、0.1％Proclin300、2％NaCl、0.5％曲拉通，其余为纯化水，pH为7.0。优选地，所述试剂R2组分为：所述乳胶-多克隆抗体交联物占所述试剂R2的质量百分比为0.5％，所述试剂R2缓冲液组分为：80mMHepes缓冲液、0.1％Proclin300、3％的蔗糖、2％NaCl、0.5％曲拉通，其余为纯化水，pH为8.0。优选地，所述胶乳颗粒为粒径为130nm的聚苯乙烯胶乳。优选地，所述多克隆抗体与乳胶颗粒的比例为75μg:1mg。优选地，所述校准品A稀释液组分为：100mMHepes缓冲液、0.1％Proclin300、3％的蔗糖、1％NaCl、0.5％曲拉通，其余为纯化水，pH为8.0。优选地，所述校准品B稀释液组分为：100mMHepes缓冲液、0.1％Proclin300、3％的蔗糖、1％NaCl、0.5％曲拉通，其余为纯化水，pH为6.0。一种基于单粒径并可同时检测血清和尿液样本中视黄醇结合蛋白的试剂盒，所述试剂R2的制备方法为：(1)将粒径为80～200nm的胶乳颗粒用pH9.0的50mM硼酸缓冲液稀释到终浓度为1％，室温反应5min；(2)加入EDC，使EDC:胶乳＝10～150μg:1mg，室温反应30min；(3)加入兔抗人RBP多克隆抗体，使兔抗人RBP多克隆抗体:胶乳＝25～100μg:1mg，混合搅拌，室温反应1h；(4)加入BSA，使BSA终浓度为1％，室温封闭2h；(5)室温15,000rpm离心去除上清；(6)用50～120mMHepes缓冲液、0.1％Proclin300、1～5％蔗糖、1～5％NaCl、0.1～1％曲拉通，其余为纯化水，pH为6.5～8.5溶解所述步骤(5)中去除上清后的胶乳-兔抗人RBP多克隆抗体，使其终浓度为0.05～1.0％，超声分散后置于4℃备用。本专利技术还提供了一种将所述的试剂盒在血清和尿液样本中检测视黄醇结合蛋白的应用。上述技术方案中，所述％为重量百分率。本专利技术的基本原理：本专利技术采用单粒径胶乳增强免疫比浊法开发本产品，其基本原理是在单粒径的高分子胶乳微球的表面包被高效价的视黄醇结合蛋白多克隆抗体，当与视黄醇结合蛋白结合后，在短时间内会迅速聚集在一起，产生一定的浊度，改变反应液透光性能，在一定抗体存在时，浊度的大小与样本中视黄醇结合蛋白的高低呈正比。在特定条件下取得校准曲线，将测定的样本浊度通过校准曲线算出样本中的视黄醇结合蛋白。与现有技术相比，本专利技术的技术方案具有如下优点：本专利技术提供的基于单粒径胶乳和多克隆抗体开发的视黄醇结合蛋白检测试剂盒，具有血尿同测、操作本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于单粒径并可同时检测血清和尿液样本中视黄醇结合蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括试剂R1、试剂R2和校准品A、校准品B，其中：所述试剂R1组分为：50～120mM Hepes缓冲液、0.1％Proclin 300、1～5％NaCl、0.1～1％曲拉通，其余为纯化水，pH 6.5～8.5；所述试剂R2包括乳胶‑多克隆抗体交联物和试剂R2缓冲液，所述乳胶‑多克隆抗体交联物占所述试剂R2的质量百分比为0.05～1.0％，所述试剂R2缓冲液组分为：50～120mM Hepes缓冲液、0.1％Proclin 300、1～5％蔗糖、1～5％NaCl、0.1～1％曲拉通，其余为纯化水，pH为6.5～8.5；所述乳胶‑多克隆抗体交联物采用胶乳颗粒和多克隆抗体制备得到；所述胶乳颗粒为粒径为80～200nm的聚苯乙烯胶乳；所述多克隆抗体与所述乳胶颗粒的比例为25～100μg∶1mg；所述校准品A包括校准品A稀释液和视黄醇结合蛋白；所述校准品A稀释液组分为：50～150mM Hepes缓冲液、0.1％Proclin 300、1～5％蔗糖、1～5％NaCl、0.1～1％曲拉通，其余为纯化水，pH为6.5～8.5；所述视黄醇结合蛋白的浓度梯度为140.00、70.00、35.00、15.00、5.00、0.00mg/L；所述校准品B包括校准品B稀释液和视黄醇结合蛋白；所述校准品B稀释液组分为：50～150mM Hepes缓冲液、0.1％Proclin 300、1～5％蔗糖、1～5％NaCl、0.1～1％曲拉通，其余为纯化水，pH为6.5～8.5；所述视黄醇结合蛋白的浓度梯度为20.00、10.00、5.00、2.50、1.00、0.00mg/L。...

【技术特征摘要】
1.一种基于单粒径并可同时检测血清和尿液样本中视黄醇结合蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括试剂R1、试剂R2和校准品A、校准品B，其中：所述试剂R1组分为：50～120mMHepes缓冲液、0.1％Proclin300、1～5％NaCl、0.1～1％曲拉通，其余为纯化水，pH6.5～8.5；所述试剂R2包括乳胶-多克隆抗体交联物和试剂R2缓冲液，所述乳胶-多克隆抗体交联物占所述试剂R2的质量百分比为0.05～1.0％，所述试剂R2缓冲液组分为：50～120mMHepes缓冲液、0.1％Proclin300、1～5％蔗糖、1～5％NaCl、0.1～1％曲拉通，其余为纯化水，pH为6.5～8.5；所述乳胶-多克隆抗体交联物采用胶乳颗粒和多克隆抗体制备得到；所述胶乳颗粒为粒径为80～200nm的聚苯乙烯胶乳；所述多克隆抗体与所述乳胶颗粒的比例为25～100μg∶1mg；所述校准品A包括校准品A稀释液和视黄醇结合蛋白；所述校准品A稀释液组分为：50～150mMHepes缓冲液、0.1％Proclin300、1～5％蔗糖、1～5％NaCl、0.1～1％曲拉通，其余为纯化水，pH为6.5～8.5；所述视黄醇结合蛋白的浓度梯度为140.00、70.00、35.00、15.00、5.00、0.00mg/L；所述校准品B包括校准品B稀释液和视黄醇结合蛋白；所述校准品B稀释液组分为：50～150mMHepes缓冲液、0.1％Proclin300、1～5％蔗糖、1～5％NaCl、0.1～1％曲拉通，其余为纯化水，pH为6.5～8.5；所述视黄醇结合蛋白的浓度梯度为20.00、10.00、5.00、2.50、1.00、0.00mg/L。2.如权利要求1所述的一种基于单粒径并可同时检测血清和尿液样本中视黄醇结合蛋白的试剂盒，所述试剂R1组分为：80mMHepes缓冲液、0.1％Proclin300、2％NaCl、0.5％曲拉通，其余为纯化水，pH为7.0。3.如权利要求1所述的一种基于单粒径并可同时检测血清和尿液样本中视黄醇结合蛋白的试剂盒，所述乳胶-多克隆抗体交联物占所述试剂R2的质量百分比为0.5％，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：柳建敏，林威彦，裘艳群，
申请(专利权)人：宁波海壹生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33