基于马泰勒虫裂殖子表面蛋白1的间接ELISA检测试剂盒制备方法技术

本发明专利技术为基于马泰勒虫裂殖子表面蛋白1的间接ELISA检测试剂盒制备方法，包括马泰勒虫EMA1蛋白的制备与马泰勒虫病rELISA检测方法的建立。本发明专利技术解决常规检测试剂盒昂贵、特异性差、耗时等缺点，建立马泰勒虫病rELISA检测方法，适用于马泰勒虫病的临床诊断和流行病学监测。

【技术实现步骤摘要】
基于马泰勒虫裂殖子表面蛋白1的间接ELISA检测试剂盒制备方法
本专利技术涉及基因重组技术，针对马泰勒虫EMA1基因的克隆、表达与制备及rELISA抗体检测试剂盒的构建，特别是基于马泰勒虫裂殖子表面蛋白1的间接ELISA检测试剂盒制备方法。
技术介绍
马泰勒虫病是由马泰勒虫引起的蜱传血液原虫病。该病主要感染马属动物(马，骡，驴和斑马)，呈急性，亚急性或慢性等。通常呈发烧，贫血，黄疸，肝脾肿大，血管内溶血，可视黏膜黄染及血红蛋白尿等表征，但慢性感染时临床症状不明显；患病马匹即使后期治愈后也会终身带虫，作为传染源传播给其它马属动物；该病广泛分布在热带和亚热带地区，据联合国粮食和农业组织的数据显示，2013年世界范围内马匹存栏量约为1.12亿匹，其中全球大约90％的马属动物分布在马泰勒病流行地区。近年来，多个国家有马泰勒虫病的报道，如韩国、蒙古、委内瑞拉、突尼斯、苏丹、意大利、匈牙利、沙特阿拉伯、墨西哥及美国德克萨斯等，对马产业造成重大经济损失；在国际马术竞技比赛中马泰勒病作为重要的检测项目之一。马泰勒病的防控为保持健康良好的国际性马产业市场至关重要。目前，对马泰勒虫病诊断方法大致可分为病原体显微镜检测方法、分子生物学技术诊断方法和血清学诊断方法。基层疫病监测部门对该病的诊断仍停留在传统的镜检法，且受到制片与染色技术等多种因素的影响，易造成漏诊和误诊，特别是相似形态虫体的鉴别诊断以及大规模的流行病学调查较为困难。近年来，马泰勒虫诊断技术逐步创新，从最早的显微镜观察虫体到现在的应用分子生物学手段检测马泰勒虫。D.P.Knowles等(1991)已报道马感染马泰勒虫后的血清抗体能与裂殖子表面抗原蛋白(EMA)发生特异性反应。且EMA极具保守性；而后重组的马泰勒虫裂殖子蛋白(EMA-1)被证实可在大肠杆菌和利用杆状病毒在昆虫细胞中表达；Salim等用EMA-2和Bc48的重组蛋白作为检测马梨形虫的ELISA包被抗原，通过对158匹份马血清样品进行马泰勒虫和驽巴贝斯虫抗体检测，也证实利用表达的重组抗原建立的ELISA检测方法的可靠性；CristianeDivanBaldani等用EMA-1基因在大肠杆菌克隆并表达出34kDaHis6-EMA1蛋白，纯化重组His6-EMA1蛋白构建ELISA检测方法，并对巴西东南部的圣保罗现场采集的170份血清样品进行检测，马泰勒虫的阳性率为95.88％(163/170)。尽管国外对于马泰勒虫病EMA1蛋白的研究较成熟，仍存在价格高昂、针对性较差等劣势。而在国内，尚缺少一种可针对马泰勒虫病地方病原进行检测的一种高效、快速的血清学检测试剂盒。基于此，本试剂盒可填补国内尚缺少一种能高效、快速、灵敏的检测马泰勒虫病的ELISA检测试剂盒这一空缺。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于马泰勒虫裂殖子表面蛋白1的间接ELISA检测试剂盒制备方法，制备高效、特异性强的马泰勒虫裂殖子表面蛋白用于ELISA诊断，解决常规检测试剂盒昂贵、特异性差、耗时等缺点，建立马泰勒虫病rELISA检测方法，适用于马泰勒虫病的临床诊断和流行病学监测。本专利技术的目的是这样实现的：一种基于马泰勒虫裂殖子表面蛋白1的间接ELISA检测试剂盒制备方法，马泰勒虫EMA1蛋白的制备：(1)在含100μg/mL氨苄青霉素的50mLLB培养基中进行诱导，测定重组蛋白的表达情况，在37℃与200rpm/min环境中诱导5h，加入1.0mMol/L的诱导剂IPTG，通过12％的十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶SDS-PAGE电泳分析蛋白质表达情况；(2)根据KCl染色切胶纯化法收集最佳诱导条件下菌体样品，菌体样品处理后进行SDS-PAGE电泳，用适量的0.25mol/L的KCl溶液染色后，切下其目的条带碾碎，加入500μL后PBS经涡旋仪混匀，置于-80℃环境中反复冻溶3次后12000r/min离心2min，取上清，用紫外分光光度仪测定上清中的蛋白浓度，再置于-20℃环境中保存备用；马泰勒虫病rELISA检测方法的建立：(1)取10μl重组蛋白样品-5μg的蛋白含量进行SDS-PAGE电泳后，半干转印于NC膜上；(2)用由0.5％Tween的PBS稀释而成的5.0％脱脂奶作为相应包含质量比为1：100的血清与脱脂奶在内的封闭液后，给酶标板中的每个孔滴加150μl封闭液，再将其置于37℃环境中封闭1.0h；(3)加入稀释的一抗-马泰勒虫阳性血清后，在37℃环境中反应1.5h；(4)加入由5.0％脱脂奶稀释而成的包含质量配比为1:10000的二抗和脱脂奶在内的二抗稀释液后，置于37℃环境中温育1.0h；(5)在NC膜上滴加DAB显色液，在避光环境中加入TMD底物溶液后，置于37℃培养箱中孵育反应10min，再加入50μL2Mol/L的H2SO4终止反应，用酶标仪在450nm处测定OD值，判定其结果。本专利技术源自GenBank数据库中已报道的不同国家和地区的马泰勒虫EMA1基因序列，通过DNAMAN软件分析下载序列的同源性，找出特异性的保守靶序列，设计特异性引物，加入酶切位点后克隆于大肠杆菌中，构建原核表达载体pEGX4T-1/EMA1进行诱导，经条件筛选后成功高效表达得到重组EMA1蛋白，进行抗原包被后制备马泰勒虫rELISA检测试剂盒。本专利技术有益技术效果：运用该检测试剂盒监测我区(新疆地区)马属动物马泰勒虫病，结合淘汰患畜的措施从而净化马群，根除该病对养马业的危害，保障畜牧业的健康发展，为保障我区畜牧业的健康发展奠定良好的基础。具体实施方式一、获得地方阳性目的基因片段(1)通过比对GenBank登录的马泰勒虫EMA1基因保守序列，使用PrimerPrimier5和PrimerExpress3.0软件设计一对引物,目的片段大小为819bp，由北京鼎国生物技术有限公司合成。引物名称Primername序列(5’-3’)sequenceEMA1-P15'-CGGATCCATGATTTCCAAATCCT-3'EMA1-P25'-TTGCGGCCGCTTAGTAAAATAGAGTAGAGT-3'(2)根据全血DNA提取试剂盒使用说明提取含有虫株的全血DNA，对提取的虫株全血DNA进行常规PCR扩增，PCR产物送至北京鼎国生物技术公司进行测序分析。反应体系为25μL：30s/94℃，30s/55℃，45s/72℃；30个循环。扩增819bp的目的基因片段。二、目的基因的克隆、测序PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测后使用胶回收试剂盒回收和纯化，将回收、纯化后的PCR产物与pMD18-T载体中，并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单菌落接种至含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，收集菌液进行测序。对重组质粒和pGEX-4T-1载体双酶切(BamHI和EcoRI)回收目的片段和空载，用T4DNAligase在16℃过夜连接，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞。测序和酶切验证正确的重组质粒pGEX-4T-1/EMA1转化至大肠杆菌菌株BL21(DE3)。三、建立马泰勒虫rELISA检测试剂盒下载GenBank数据库中已报道的不同国家和地区的马泰勒虫EMA1基因序列，通过DNAMAN软件分析下载序列的同源性，找出特异性的保守靶序列，设计本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于马泰勒虫裂殖子表面蛋白1的间接ELISA检测试剂盒制备方法，其特征是：马泰勒虫EMA1蛋白的制备：（1）在含100μg/mL氨苄青霉素的50mLLB培养基中进行诱导，测定重组蛋白的表达情况，在37℃与200rpm/min环境中诱导5h，加入1.0mMol/L的诱导剂IPTG，通过12%的十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶SDS‑PAGE电泳分析蛋白质表达情况；（2）根据KCl染色切胶纯化法收集最佳诱导条件下菌体样品，菌体样品处理后进行SDS‑PAGE电泳，用适量的0.25mol/L的KCl溶液染色后，切下其目的条带碾碎，加入500μL后PBS经涡旋仪混匀，置于‑80℃环境中反复冻溶3次后12000r/min离心2min，取上清，用紫外分光光度仪测定上清中的蛋白浓度，再置于‑20℃环境中保存备用；马泰勒虫病rELISA检测方法的建立：（1）取10μl重组蛋白样品‑5μg的蛋白含量进行SDS‑PAGE电泳后，半干转印于NC膜上；（2）用由0.5%Tween的PBS稀释而成的5.0%脱脂奶作为相应包含质量比为1：100的血清与脱脂奶在内的封闭液后，给酶标板中的每个孔滴加150μl封闭液，再将其置于37℃环境中封闭1.0h；（3）加入稀释的一抗‑马泰勒虫阳性血清后，在37℃环境中反应1.5h；（4）加入由5.0%脱脂奶稀释而成的包含质量配比为1:10000的二抗和脱脂奶在内的二抗稀释液后，置于37℃环境中温育1.0h；（5）在NC膜上滴加DAB显色液，在避光环境中加入TMD底物溶液后，置于37℃培养箱中孵育反应10min，再加入50μL2Mol/L的H2SO4终止反应，用酶标仪在450nm处测定OD值，判定其结果。...

【技术特征摘要】
1.一种基于马泰勒虫裂殖子表面蛋白1的间接ELISA检测试剂盒制备方法，其特征是：马泰勒虫EMA1蛋白的制备：（1）在含100μg/mL氨苄青霉素的50mLLB培养基中进行诱导，测定重组蛋白的表达情况，在37℃与200rpm/min环境中诱导5h，加入1.0mMol/L的诱导剂IPTG，通过12%的十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶SDS-PAGE电泳分析蛋白质表达情况；（2）根据KCl染色切胶纯化法收集最佳诱导条件下菌体样品，菌体样品处理后进行SDS-PAGE电泳，用适量的0.25mol/L的KCl溶液染色后，切下其目的条带碾碎，加入500μL后PBS经涡旋仪混匀，置于-80℃环境中反复冻溶3次后12000r/min离心2min，取上清，用紫外分光光度仪测定上清中的蛋白浓度，再置于-20℃环境中保存备用；马泰勒...

【专利技术属性】
技术研发人员：巴音查汗·盖力克，张杨，郭庆勇，宋瑞其，刘世芳，李永畅，王盼举，闻秀秀，谢小婉，张梦圆，
申请(专利权)人：新疆农业大学，
类型：发明
国别省市：新疆,65