一种新型猪圆环病毒3型的ELISA抗体检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种新型猪圆环病毒3型的ELISA抗体检测试剂盒及其应用。本发明专利技术的试剂盒组成包括：以重组PCV3 Cap蛋白作为包被抗原的酶标板、PCV3标准阳性血清、PCV3标准阴性血清、酶标二抗、洗涤液、血清稀释液、底物显色液A、底物显色液B和终止液；首次成功研制针对猪圆环病毒III型的新型PCV3 ELISA抗体检测试剂盒。本发明专利技术的试剂盒具有很好特异性和灵敏性，检测时间短，可同时检测大量样品；试剂盒保存时间长，稳定性好，为该病的诊断、检测和监测等提供了有力的工具。

【技术实现步骤摘要】
一种新型猪圆环病毒3型的ELISA抗体检测试剂盒及其应用
本专利技术涉及生物检测
，特别涉及一种新型猪圆环病毒3型的ELISA抗体检测试剂盒及其应用。
技术介绍
圆环病毒属于圆环病毒科圆环病毒属，其基因组为一个2kb左右的环状单链DNA。圆环病毒可以感染多种动物，包括猪、犬、鸭、鸡、狐狸和鱼类。圆环病毒主要编码两个开放性阅读框(rep和cap)。众所周知，有两个圆环病毒可以感染猪。猪圆环病毒2型(PCV2)感染可以导致不同的临床疾病，对养猪业造成严重的经济损失，而圆环病毒1型(PCV1)不引起临床疾病。2015年，美国研究人员通过宏基因组测序，在美国检测到一个新型圆环病毒(PCV3)，该圆环病毒与皮炎肾病综合征、繁殖障碍、心肌炎以及多系统炎症相关。PCV3属于新发猪重大疫病病原，2016年12月首次出现在中国，该病与仔猪多系统衰竭症以及母猪流产有关，正给猪养殖业带来严重威胁。2016年12月，华南农业大学宋长绪研究员组在我国首次检出致病性的新型猪圆环病毒—PCV3-China/GD2016病毒株，通过对PCV3毒株全基因组和其部分基因的遗传进化研究发现，PCV3与PCV1和PCV2处于不同的进化分支(图1)，属于新型的猪圆环病毒(Genomecharacterizationofaporcinecircovirustype3inSouthChina,ChangxuSong,TransboundEmergDis.2017Mar13.)。猪圆环病毒III型是严重危害我国养猪业的一个猪病，抗体检测是防控的关键，然而目前国内外尚无成熟的、商品化的PCV3的ELISA抗体检测试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种新型猪圆环病毒3型的ELISA抗体检测试剂盒。本专利技术以重组PCV3抗原(PCV3的Cap蛋白)为基础，研制灵敏度高、特异性和稳定性好的ELISA抗体检测试剂盒，可用于PCV3病毒抗体的快速检测。本专利技术的又一目的在于提供所述的新型猪圆环病毒3型的ELISA抗体检测试剂盒的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种新型猪圆环病毒3型的ELISA抗体检测试剂盒，包括：以重组PCV3Cap蛋白作为包被抗原的酶标板。所述的新型猪圆环病毒3型的ELISA抗体检测试剂盒还包括：PCV3标准阳性血清、PCV3标准阴性血清、酶标二抗、洗涤液、血清稀释液、底物显色液A、底物显色液B和终止液中的一种或至少两种。所述的重组PCV3Cap蛋白具有如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。所述的重组PCV3Cap蛋白来自于猪圆环病毒3型核衣壳蛋白，特别是来自于猪圆环病毒PCV3-China/GD2016病毒株。编码所述的重组PCV3Cap蛋白的核苷酸序列，如SEQIDNO.2所示。所述的重组PCV3Cap蛋白通过以下步骤制备得到：将编码所述的重组PCV3Cap蛋白的核苷酸序列克隆入表达载体构建重组表达载体；将所述重组表达载体转入表达系统中进行表达，纯化，得到所述的重组PCV3Cap蛋白。所述的构建重组表达载体的具体步骤优选为：针对编码所述的重组PCV3Cap蛋白的核苷酸序列，通过设计引物进行PCR，将得到的PCV3-Cap基因片段双酶切后与表达载体连接构建得到重组表达载体。其中，所述的引物为：上游引物：5’-GGCggatccATGAGACACAGACCTATATTC-3’，下游引物为：5’-GGGctcgagGAGAACTGACTTGTAACGAAT-3’，其中，小写字母分别表示酶切位点BamHI和XhoI。所述的双酶切的方法优选为通过限制性内切酶BamHI和XhoI对PCV3-Cap基因片段和载体分别进行双酶切。所述的表达系统优选为大肠杆菌、杆状病毒表达系统、真核哺乳动物细胞表达系统和植物表达系统中的一种或至少两种；进一步优选为大肠杆菌(Rosetta菌株)和杆状病毒表达系统中的一种或至少两种。上述的核苷酸序列、氨基酸序列，包含但不限于：将本专利技术所提供的序列，经突变(mutation)、删除(deletion)、插入(insertion)、或取代(replacement)等现有方式，将1至复数个核苷酸或氨基酸改变，但仍适用本专利技术目的。更优选地，其应至少具有80％的序列互补性(complementary)，或是至少90％的序列同一性(Identitty)。所述的删除还包括删除第1～35位中的1至复数个氨基酸；进一步优选为删除包含第1-28位中的1至复数个氨基酸。所述的以重组PCV3Cap蛋白作为包被抗原的酶标板，通过如下步骤制备得到：将重组PCV3Cap蛋白稀释到2μg/mL，100μL/孔加到酶标板，37℃温育24h；取包被好的酶标板，300μL/孔洗涤液洗板2～5次，2～5分钟/次；再加入150μL/孔封闭液，37℃温育2h；取封闭后的酶标板，300μL/孔洗涤液洗板2～5次，2～5分钟/次，制备得到以重组PCV3Cap蛋白作为包被抗原的酶标板。所述的包被液优选为pH值为9.6的碳酸钠缓冲液。所述的包被液优选通过如下步骤制备得到：将1.59gNa2CO3、2.93gNaHCO3溶于900mL双蒸水中至完全溶解后，调节pH至9.6，定容至1L，即得所述的包被液。所述的封闭液优选为含3％明胶的PBST缓冲液。所述的含3％明胶的PBST缓冲液优选通过如下步骤制备得到：取3％的明胶，溶于800mL稀释至1倍的洗涤液，完全溶解后，定容至1L，即得所述的含3％明胶的PBST缓冲液。所述的酶标二抗优选为HRP标记的兔抗猪IgG抗体。所述的底物显色液A优选为过氧化脲溶液；底物显色液B优选为四甲基联苯胺(TMB)溶液。所述的洗涤液优选通过如下步骤制备得到：称取8.71gNaCl、0.26gKH2PO4、2.89gNa2HPO4·12H2O溶于900mL双蒸水中，至完全溶解后，加入0.5mLTween-20，定容至1L，即得所述的洗涤液。所述的血清稀释液优选为稀释至1倍的所述的洗涤液。所述的终止液优选为2M浓硫酸。所述的新型猪圆环病毒3型的ELISA抗体检测试剂盒在猪圆环病毒III型检测中的应用。所述的应用包括以下步骤：(1)用血清稀释液将待测血清样品稀释，将PCV3标准阳性血清、PCV3标准阴性血清、稀释后的待检血清样品各100μL/孔加到前述酶标板中，23～28℃孵育1h；(2)用洗涤液洗板，300μL/孔，洗3～5次；(3)每孔加入100μL酶标二抗，23～28℃孵育30分钟；(4)用洗涤液洗板，300μL/孔，洗3～5次；(5)取底物显色液A和底物显色液B等体积混匀，每孔加100μL，在暗处显色15分钟；(6)每孔加入50μL的终止液终止反应；(7)在波长为450nm处测OD值；(8)结果判读：OD450nm(样本)≥0.4判为阳性，OD450nm(样本)＜0.2判为阴性，当0.2≤OD450nm(样本)＜0.4判为可疑。本专利技术试剂盒的检测原理是：ELSIA技术是一种免疫学测定，主要通过抗原抗体反应监测液体样本中的抗体或抗原性物质，是一种应用免疫学技术测定标本中目的蛋白性质、功能和含量的方法。间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体(抗猪免疫球蛋白抗体)以检测与固相抗原结合的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新型猪圆环病毒3型的ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：包括以重组PCV3Cap蛋白作为包被抗原的酶标板。

【技术特征摘要】
1.一种新型猪圆环病毒3型的ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：包括以重组PCV3Cap蛋白作为包被抗原的酶标板。2.根据权利要求1所述的新型猪圆环病毒3型的ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于还包括：PCV3标准阳性血清、PCV3标准阴性血清、酶标二抗、洗涤液、血清稀释液、底物显色液A、底物显色液B和终止液中的一种或至少两种。3.根据权利要求1所述的新型猪圆环病毒3型的ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：所述的重组PCV3Cap蛋白具有如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列；或是具有通过突变、删除、插入或取代方式将如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列中的至少1个氨基酸改变的序列。4.根据权利要求1所述的新型猪圆环病毒3型的ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：所述的重组PCV3Cap蛋白来自于猪圆环病毒3型核衣壳蛋白。5.根据权利要求1所述的新型猪圆环病毒3型的ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述的重组PCV3Cap蛋白通过以下步骤制备得到：将编码所述的重组PCV3Cap蛋白的核苷酸序列克隆入表达载体构建重组表达载体；将所述重组表达载体转入表达系统中进行表达，纯化，得到所述的重组PCV3Cap蛋白。6.根据权利要求1所述的新型猪圆环病毒3型的ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：所述的以重组PCV3Cap蛋白作为包被抗原的酶标板，通过如下步骤制备得到：将重组PCV3Cap蛋白稀释到2μg/mL，100μL/孔加到酶标板，37℃温育24h；取包被好的酶标板，300...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋长绪，王磊，申翰钦，张乐宜，刘艳玲，梁鹏帅，张鹏飞，刘相聪，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44