一株肉座菌目真菌、其胞外多糖的制备方法和应用技术

一株肉座菌目真菌(Hypocreales sp.)菌株，命名为KLBMP‑Pt686，其保藏编号为CGMCC No.14981，其能用于制备抗氧化损伤的多糖，所制备的胞外多糖具有很好的保护细胞免受氧化损伤的作用。本发明专利技术的肉座菌目真菌(Hypocreales sp.)菌株的胞外多糖提取方法工艺简单易行、条件温和、易于控制。

Preparation and application of an exorexa polysaccharide from a fungus

A strain of Hypocreales sp. was named KLBMP_Pt686. Its preservation number was CGMCC No. 14981. It can be used to prepare polysaccharides against oxidative damage. The prepared extracellular polysaccharides have a good protective effect against oxidative damage. The method for extracting extracellular polysaccharides from the strains of Hypocreales sp. is simple, feasible, mild and easy to control.

【技术实现步骤摘要】
一株肉座菌目真菌、其胞外多糖的制备方法和应用
本专利技术涉及生物医药保健品领域，尤其涉及一株肉座菌目真菌(Hypocrealessp.)菌株CGMCCNo.14981及其胞外多糖的制备方法和所制备的多糖的在保护细胞免受氧化损伤中的应用。
技术介绍
真菌多糖是真菌在生长代谢过程中产生的高分子多聚物。多糖的结构非常复杂，通常由10个以上的单糖组合而成，有些真菌多糖还含有多肽和脂类等成分。真菌多糖具有很好的抗肿瘤功能，还具有很好的抗菌、刺激免疫系统、抗氧化、抗疲劳等功能。真菌多糖具有丰富的生物活性，且无毒副作用，作为药物新资源和保健食品具有广阔的开发前途。
技术实现思路
一株肉座菌目真菌(Hypocrealessp.)菌株，命名为KLBMP-Pt686，其保藏编号为CGMCCNo.14981，此构成本专利技术的第一个方面。肉座菌目真菌(Hypocrealessp.)菌株KLBMP-Pt686的胞外多糖的制备方法构成本专利技术的第二方面，包括步骤：S1：将所述肉座目真菌菌株活化培养后接种到培养基上进行发酵培养；S2：将发酵培养后得到的发酵液进行离心得上清液，将上清液进行醇沉、过滤得沉淀物；S3：对沉淀物进行复溶和离心去掉不能复溶杂质，并采用Sevag法除去可溶性蛋白杂质，除可溶性蛋白杂质后的样液减压浓缩除去其中混溶的正丁醇，加适量水复溶，再加入95％的乙醇，4℃沉降过夜，过滤，乙醇洗涤两次，挥去乙醇后得胞外多糖粗品。S4：采用凝胶柱层析法精制粗多糖。所制备的胞外多糖在保护细胞免受氧化损伤中的应用构成本专利技术的第三个方面。本专利技术的有益效果：1.本专利技术提供了一种肉座菌目真菌(Hypocrealessp.)KLBMP-Pt686，其能用于制备抗氧化损伤多糖；2.由肉座菌目真菌(Hypocrealessp.)KLBMP-Pt686所制备的胞外多糖，具有很好的保护细胞免受氧化损伤的作用。3.本专利技术的胞外多糖提取方法工艺简单易行、条件温和、易于控制。本专利技术的菌种保藏日期为2017年11月24日，保藏编号为：CGMCCNo.14981。分类名称为：肉座菌目真菌(Hypocrealessp.)，保藏单位名称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。附图说明图1为本专利技术实施例1所述的菌株KLBMP-Pt686在马铃薯琼脂培养基上的菌落和菌丝照片，其中左图为菌落，右图为菌丝；图2为本专利技术实施例2所述的菌株KLBMP-Pt686胞外多糖纯品实物照片；图3为本专利技术实施例2所述的菌株KLBMP-Pt686胞外多糖纯品HPLC谱图；图4为本专利技术实施例3所述的各单糖标准品和菌株KLBMP-Pt686胞外多糖水解产物的乙酰化产物气相色谱图，其中，图中(a)-(c)为单糖标准品乙酰化产物气相色谱图，(d)为多糖样品水解产物的乙酰化产物气相色谱图；图5为本专利技术实施例4中的KLBMP-Pt686胞外多糖对H2O2诱导的细胞氧化损伤保护效果图，其中，A为对照图，B为H2O2损伤组，C为多糖处理组；图6为本专利技术实施例4中的不同浓度的胞外多糖对H2O2诱导的氧化损伤的细胞存活率的影响统计结果。具体实施方式：实施例1：菌株KLBMP-Pt686的鉴定挑取保存于斜面管的真菌菌株KLBMP-Pt686接种在PDA培养基，置于26℃恒温培养箱中培养。观察记录菌株菌落的生长速度、形态、菌丝的颜色、菌丝致密度、孢子堆和有无色素产生等变化情况。采用插片法显微观察菌株菌丝和孢子特征：将固体培养基倒入培养皿中，厚度约0.3-0.5mm，待凝固后，挑取待测菌株置于培养皿中央，接着用无菌的镊子将无菌的盖玻片以45度角的倾斜度插入距中央菌块约2cm处的培养基中，然后将其放置在26℃培养箱中培养。待菌丝长过插片的位置后，取出玻片进行显微观察，结果如图1所示。菌株KLBMP-Pt686在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(自然PH)，26℃下生长良好，菌落成淡黄色，菌落稠密，呈肉质状，色泽鲜艳。菌体丝状，分生孢子梗轮生，顶端着分生孢子，分生孢子呈梭形。利用真菌通用引物ITS5(5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3')和ITS4(5'-TCCGCTTATTGATATGC-3')经PCR反应扩增出该菌株的ITS序列如SEQIDNo.1所示，与GenBank上的数据比对，选取相似度较高的菌株序列，利用MEGA5.01软件以Neighbor-Joining计算方式生成系统发育进化树。该菌株与Hypocrealessp.E14023c在同一个分支内，且相似性为99％。结合形态学特征，鉴定其为肉座菌目真菌(Hypocrealessp.)的一个菌株，将其命名为肉座菌目真菌(Hypocrealessp.)KLBMP-Pt686。实施例2：菌株KLBMP-Pt686的胞外多糖的分离纯化菌株KLBMP-Pt686液体发酵产物4000r/min离心去菌丝体，上清液加入3.5倍体积的95％的乙醇，沉降过夜，过滤得沉淀。加入3倍于沉淀量的水进行复溶，4000r/min离心去掉不能复溶的杂质。采用Sevag法除可溶性蛋白杂质。在去蛋白过程中，样液与Sevag试剂体积比为4：1混合，高速搅拌20min后置分液漏斗中静止分层，除去下层。经过反复多次除去多糖中的游离蛋白。除过蛋白后的多糖样液减压浓缩除去其中混溶的正丁醇，加适量水复溶。再加入3.5倍体积的95％的乙醇，4℃沉降过夜，过滤，用乙醇洗涤两次，挥去乙醇得粗多糖。粗多糖精制采用凝胶柱层析法。所用层析柱高为50cm，内直径3.6cm，柱填料为Bio-GelP30，流动相为ddH2O,流速为1.5mL/min。将粗多糖样品配制成浓度为40mg/mL的水溶液，每次上样量为1mL。按5mL/管自动收集。多次重复上述实验进行制备。对收集到的各管采用蒽酮比色法进行检测，检测到多糖的各管进行冷冻干燥，得精制纯品多糖，其实物照片如图2所示。所得胞外多糖分子量的测定方法为凝胶柱层析法。所用柱填料为葡聚糖凝胶G-100(分离范围：3000-120000Da)，柱高为40cm，柱内直径1.7cm；流动相为纯水；流速为1.0mL/min；检测器为蒸发光检测器(漂移管温度：80℃，气流量：5.0L/min)。将葡聚糖分子量标准品及样品用水配制成10mg/mL的溶液，上样量为100μL。以标准品分子量对数为纵坐标，以保留时间为横坐标，制作标准曲线；将样品保留时间代入标准曲线计算其分子量。同时根据峰型及分布情况考察样品的纯度。结果如图3所示，其中，横坐标为保留时间，纵坐标为信号强度。根据标准曲线和样品保留时间计算其分子量为53.0kDa，其色谱图峰形较窄且均匀，说明样品均一性较好，纯度较高。实施例3：胞外多糖的组分测定(1)多糖样品的水解：称取各多糖样品10mg于安瓿瓶中,加入2mol/L硫酸1.5mL，火焰密封，水浴90℃水解11h。将水解液转至烧杯中用碳酸钡粉末调pH至中性，先用砂芯漏斗抽滤，再用0.45μm滤膜过滤，减压浓缩至干，备用。(2)样品的乙酰化：准确称取各单糖标准品10mg，向上述水解样品及单糖标准品中分别加入5mg盐酸羟胺和0.5mL吡啶，水浴90℃反应30min,取出冷却至室温，加入0.5mL乙酸酐，水浴本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株肉座目真菌(Hypocreales sp.)菌株，其保藏编号为：CGMCC No.14981。

【技术特征摘要】
1.一株肉座目真菌(Hypocrealessp.)菌株，其保藏编号为：CGMCCNo.14981。2.权利要求1中的肉座菌目真菌(Hypocrealessp.)的胞外多糖的制备方法，其特征在于，包括步骤：S1：将所述肉座目真菌菌株活化培养后接种到培养基上进行发酵培养；S2：将发酵培养后得到的发酵液进行离心得上清液，将上清液进行醇沉、过滤得沉淀物；S3：对沉淀物进行复溶和离心去掉不能复溶杂质，并采用Sevag法除去可溶性蛋白杂质，得肉座菌目真菌(Hypocrealessp.)的胞外多糖粗品。S4:采用凝胶柱层析...

【专利技术属性】
技术研发人员：鞠秀云，张健，刘金娟，陈子涵，
申请(专利权)人：江苏师范大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32