5-酮基米尔贝霉素发酵液的提取和结晶工艺制造技术

本发明专利技术公开了一种5‑酮基米尔贝霉素发酵液的提取和结晶工艺。包括发酵液的预处理；菌丝体浸泡提取、过滤浓缩；正庚烷萃取，浓缩，搅拌结晶；正庚烷淋洗，烘干等步骤。通过本发明专利技术工艺生产的5‑酮基米尔贝霉素晶体，纯度高达99％，比5‑酮基米尔贝霉素粗品提高了25‑35％，且工艺简单，收率高，同时具有良好的稳定性；该工艺在生产过程中不涉及硅胶柱色谱纯化工艺，节约成本并极大降低了环保压力。

【技术实现步骤摘要】
5-酮基米尔贝霉素发酵液的提取和结晶工艺
本专利技术涉及化合物分离纯化
，更具体地说，涉及一种5-酮基米尔贝霉素发酵液的提取和结晶工艺。
技术介绍
5-酮基米尔贝霉素A3：R＝CH3；A4：R＝CH2CH35-酮基米尔贝霉素(5-oxomilbemycins)是一种十六元环大环内酯化合物，是米尔贝肟的前体，其A3、A4组份经肟化反应即可得米尔贝肟A3和A4。米尔贝肟(milbemycinoxime)是驱虫药，由日本三共株式会社于1986年上市。米尔贝肟具有广谱的抗寄生虫作用，对体内、体外寄生虫特别是线虫和节肢动物有良好的驱杀作用，对控制和预防大部分常见寄生虫疾病都有很好的效果。通常用来预防恶丝虫病，控制线虫、钩虫引发的犬、猫疾病及犬的鞭虫病。由于米尔贝肟杀虫活性高、毒性小，LD50是临床推荐用量的2000倍以上，同时对阿维菌素类药物敏感的犬毒性较小，所以具有很好的市场前景。目前，米尔贝肟是通过半合成的方法生产。常规的工艺路线是由吸水链霉菌(Streptomyces.Hygroscopicus)或冰城链霉菌(Streptomyces.Bingchenggensis)等菌株发酵产生米尔贝霉素，经氧化反应获得中间体5-酮基米尔贝霉素，再与盐酸羟胺发生肟化反应获得终产品米尔贝肟。已报道的提取工艺和米尔贝肟制备工艺都是基于此技术路线，中间体5-酮基米尔贝霉素均以浓缩粗提物直接参与肟化反应，纯度低，稳定性极差，极易降解，不利于中间体杂质的研究，不符合新EP标准。中国专利CN105254644A中公开的方法也是以米尔贝霉素为原料氧化获得米尔贝酮，其浓缩液用乙醇水溶液溶解后，再采用正庚烷与丙酮混合溶剂萃取两次得到米尔贝酮纯化品。这种方法采用混合溶剂萃取两次，操作过程复杂，且因提取的纯化品未进一步结晶，导致粗提物纯度低，稳定性差。本实验室利用基因工程技术构建了能直接发酵产生5-酮基米尔贝霉素的基因工程菌F2-18(文献黄隽,林甲檀,周敏等.吸水链霉菌HS023milF基因敲除构建产5-酮米尔贝霉素基因工程菌.《微生物学报》,2015,55(1):107-113)，省去了氧化反应步骤，但关于5-酮基米尔贝霉素发酵液的提取分离工艺和结晶工艺却无相关报道。因此，研究5-酮基米尔贝霉素的分离纯化和结晶工艺对于简化整体工艺，提高中间体的纯度和稳定性非常有必要，且有利于中间体杂质的研究。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于提供一种5-酮基米尔贝霉素发酵液的提取和结晶工艺，该技术操作简单，结晶效果好，得到的5-酮基米尔贝霉素晶体纯度高，收率高。为了实现上述目的，本专利技术结合5-酮基米尔贝霉素发酵液的物理和化学性质，开发出了一条新型、紧凑、经济的提取和结晶工艺，该工艺包括以下工艺单元：发酵液预处理；菌丝体浸泡提取、过滤浓缩；正庚烷萃取、浓缩，搅拌结晶；正庚烷淋洗、烘干；具体如下：1)将5-酮米尔贝霉素的发酵液过滤后，收集菌丝体；2)将步骤1)中的菌丝体采用乙醇或甲醇浸泡、过滤、得5-酮米尔贝霉素提取液，浓缩，得到5-酮米尔贝霉素浓缩液；3)将步骤2)中的5-酮米尔贝霉素浓缩液采用正庚烷进行萃取，将所得的正庚烷相进行浓缩，搅拌结晶得结晶液；4)将步骤3)中结晶液过滤，正庚烷淋洗，烘干，即得到5-酮基米尔贝霉素晶体。作为优选，所述步骤1)中5-酮米尔贝霉素产生菌为链霉菌F2-18。作为优选，所述步骤2)中所用的甲醇或乙醇的体积浓度为80％-100％。作为优选，所述步骤2)中使用乙醇浸泡时，乙醇与菌丝体的用量比为4:1～10:1，更优选为5:1(V/W,单位L/Kg)；作为优选，所述步骤2)中使用甲醇浸泡时，甲醇与菌丝体的用量比为4:1～10:1，更优选为5:1(V/W,单位L/Kg)。作为优选，所述步骤2)中的5-酮米尔贝霉素提取液浓缩时，浓缩至乙醇或甲醇的体积浓度为45-55％。作为优选，所述步骤2)和步骤3)中的浓缩采用减压浓缩，负压为0.08～0.1Mpa。作为优选，所述步骤3)中5-酮米尔贝霉素浓缩液萃取时，正庚烷与5-酮米尔贝霉素浓缩液体积比为1:1～2:1。作为优选，所述步骤3)中正庚烷浓缩时正庚烷相温度控制在30～40℃。作为优选，所述步骤3)中正庚烷相浓缩至5-酮米尔贝霉素的浓度为50mg/ml～150mg/ml。作为优选，所述步骤3)中的搅拌时间为20～30小时。作为优选，所述步骤4)中的烘干温度为30～40℃，烘干时间2～3小时。本专利技术中所述的5-酮基米尔贝霉素是指一种十六元环大环内酯化合物，是米尔贝肟的前体，其结构如下：5-酮基米尔贝霉素A3：R＝CH3；A4：R＝CH2CH3，所述5-酮米尔贝霉素的纯度为A3和A4组分的纯度之和；所述5-酮米尔贝霉素的浓度为A3和A4组分的浓度之和。本专利技术中的常温是指20～25℃。本专利技术的有益效果是：本专利技术提供的5-酮基米尔贝霉素发酵液的提取和结晶工艺，可以得到高纯度的5-酮基米尔贝霉素的晶体，具有收率高，操作简单易实现，且获得的5-酮基米尔贝霉素稳定性良好；克服了现有技术操作过程中中间体极不稳定的缺点，易储存，可以长期存放；适合米尔贝肟生产中的提纯工艺；经过本专利技术工艺方法提纯后的5-酮基米尔贝霉素纯度高达99％，有效降低了杂质含量；生产过程中不涉及硅胶柱色谱纯化工艺，大大节约了成本并极大降低了环保压力。附图说明图1为实施例2中正庚烷相中的5-酮米尔贝霉素的HPLC检测图谱。图2为实施例4中5-酮米尔贝霉素晶体的HPLC检测图谱。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的说明。5-酮米尔贝霉素通过HPLC进行检测：HPLC柱：伊利特C-18反相柱，150mm*4.6mm；5μm；紫外吸收波长：240nm；流动相：乙腈:水(V/V)＝85:15；流动相流速：1.0ml/min。实施例1：5-酮基米尔贝霉素发酵液的制备5-酮基米尔贝霉素产生菌链霉菌F2-18为链霉菌HS023(Streptomycesmilbemycinicus，保藏编号为CGMCCNo.7677)通过基因重组技术获得的基因工程菌，参考文献黄隽,林甲檀,周敏等.吸水链霉菌HS023milF基因敲除构建产5-酮米尔贝霉素基因工程菌.《微生物学报》,2015,55(1):107-113。采用该工程菌制备5-酮基米尔贝霉素发酵液的方法参照专利技术专利CN201310541829.8。1、从冻存管中取链霉菌F2-18孢子悬液接种于固体MS培养基(甘露醇20g/L，黄豆粉20g/L，琼脂20g/L)的平板上，28℃培养7天；2、将培养好的菌孢子接种于装有10L种子培养基的15L种子罐中，于28±1℃培养48小时后，得到种子液备用；种子培养基配方(g/L)：蔗糖10、脱脂奶粉1、蛋白胨3.5、酵母膏5、磷酸二氢钾0.5，泡敌2.5，调节pH值为7.2，灭菌；3、在装有30L发酵培养基的50L发酵罐中，以2L的接种量接入步骤2中制备的种子液开始发酵；1)发酵培养基配方(g/L)：蔗糖160、黄豆饼粉20、酵母膏5、麦芽膏5、磷酸二氢钾0.5、硫酸亚铁0.5、碳酸钙3，硫酸镁0.5，泡敌2.5，调节pH值为7.2，灭菌；2)发酵工艺接种量：10％，通气量：0.6vvm，发酵温度：28±1℃，搅拌转速150rpm，溶氧本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种5‑酮基米尔贝霉素发酵液的提取和结晶工艺，其特征在于包括以下步骤：1)将5‑酮米尔贝霉素发酵液过滤后，收集菌丝体；2)将步骤1)中的菌丝体采用乙醇或甲醇浸泡、过滤、得5‑酮米尔贝霉素提取液，浓缩，得到5‑酮米尔贝霉素浓缩液；3)将步骤2)中的5‑酮米尔贝霉素浓缩液采用正庚烷进行萃取，将所得的正庚烷相进行浓缩，搅拌结晶得结晶液；4)将步骤3)中结晶液过滤，正庚烷淋洗，烘干，即得到5‑酮基米尔贝霉素晶体。

【技术特征摘要】
1.一种5-酮基米尔贝霉素发酵液的提取和结晶工艺，其特征在于包括以下步骤：1)将5-酮米尔贝霉素发酵液过滤后，收集菌丝体；2)将步骤1)中的菌丝体采用乙醇或甲醇浸泡、过滤、得5-酮米尔贝霉素提取液，浓缩，得到5-酮米尔贝霉素浓缩液；3)将步骤2)中的5-酮米尔贝霉素浓缩液采用正庚烷进行萃取，将所得的正庚烷相进行浓缩，搅拌结晶得结晶液；4)将步骤3)中结晶液过滤，正庚烷淋洗，烘干，即得到5-酮基米尔贝霉素晶体。2.根据权利要求1所述一种5-酮基米尔贝霉素发酵液的提取和结晶工艺，其特征在于所述步骤1)中5-酮米尔贝霉素产生菌为链霉菌F2-18。3.根据权利要求1所述一种5-酮基米尔贝霉素发酵液的提取和结晶工艺，其特征在于所述步骤2)中所用的甲醇或乙醇的体积浓度为80％-100％。4.根据权利要求1所述一种5-酮基米尔贝霉素发酵液的提取和结晶工艺，其特征在于所述步骤2)中使用乙醇浸泡时，乙醇与菌丝体的用量比为4:1～10:1，优选为5:1(V/W,单位L/Kg)。5.根据权利要求1所述一种5-酮基米尔贝霉素发酵液的提取和结晶工艺，其特征在于所述步骤2)中使用甲醇浸泡时，甲醇与菌丝体的用量比为4:1～10:1，优选为5:1(V/W,单位L/Kg)。...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈敢锋，余贞，滕云，叶小形，阮海宁，郑玲辉，
申请(专利权)人：浙江海正药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33