通过内部标准物质谱检测微生物的方法及其产品技术

本发明专利技术提供一种通过内部标准物来质谱检测微生物的方法，该内部标准物具有已知的分子量和质荷比，其在微生物检测过程中并不干扰微生物特征蛋白的峰值谱图。本发明专利技术还提供了所述内部标准物组合、试剂组合物及其相关检测产品。本发明专利技术中利用内部标准物质校正单个微生物样品检测的方法，可适用于包括真菌，细菌等各类用于MALDI‑TOF MS检测的微生物样品中，提高微生物鉴定的准确率，同时弥补了目前市场上只有外部标准物做校正的不足。

【技术实现步骤摘要】
通过内部标准物质谱检测微生物的方法及其产品
本专利技术属于生物
，涉及用于飞行时间质谱系统检测微生物样品检测的内标校正。
技术介绍
基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix-assistedlaserdesorptionlionizationtimeofflightmassspectrometry,MALDI-TOF-MS)技术，是近年来飞速发展的蛋白质组学、基因组学技术之一，具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点，为生命科学研究与临床重大疾病预警和辅助诊断等提供快速、高通量的分析测试手段，同时也是一种很好的鉴定病原微生物的方法。MALDI-TOF-MS的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比(M/Z)与离子的飞行时间成正比，检测离子。尽管MALDI-TOF-MS的准确度高达0.1％～0.01％，远远高于目前常规应用的SDS电泳与高效凝胶色谱技术。MALDI-TOFMS技术具有快速、准确、稳定、高通量、低成本等特点；MALDI-TOFMS技术是临床微生物的常规快速分析技术，也是耐药微生物的分析技术之一；MALDI-TOFMS技术为有病原菌资源库的构建提供了有效的鉴定技术支持。但由于系统误差等因素影响实验结果的精确定量，因此在质谱检测样品时，引入已知浓度和比例的内标，从而提高单个微生物样品鉴定的准确度和精密度。目前曲线拟合的方法在国内外均有较为普遍的应用，JiangyueWu等(Anal.Chem.1997,69,3767-3771)利用MALDI-TOF-MS的拟合曲线法对环孢菌素进行了定量测试；Mazarin等(Anal.Chem.2006,78,2758-2764)结合脉冲梯度旋转核磁共振和MALDI-TOF-MS定量测定多聚物时，同样采用了拟合曲线进行数据校正；2009年，吕爽等人利用拟合曲线，成功开发了一种磷酸化肽的MALDI-TOF-MS定量方法。该技术是在完整的微生物中添加酸性基质辅助细胞裂解，激光激发细胞裂解物(小蛋白或多肽)形成肽质量指纹谱，与已构建的属、种水平的共性参考谱库进行比对分析，从而实现微生物的鉴定。而各种特征肽或肽指纹的检测结果通过一系列具有特定质荷比(M/Z)的峰值曲线进行标识。在利用MALDI-TOFMS质谱仪采集样本的准确性是蛋白指纹谱微生物识别体系的关键因素，如果在检测过程中由于细胞裂解物的杂质或系统误差(继续补充)的影响，会导致检测结果的峰值曲线出现一定程度的误差(例如1-10个Da分子量的峰值偏移)，因此一般需要通过标准物进行校正，以使得测定峰值曲线与实际峰值曲线吻合。袁湘林等(《分析化学研究报告》，2001年第29卷第1期)报道了在基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱用于人参皂甙Rg3的定量分析中，选择芦丁作为内标物,在重现性和线性方面都优于棉子糖。分辨率的提高以及以相对峰面积代表待测物浓度，可使平均相对误差明显降低,改善定量结果。然而，该方法并非用于质谱检测微生物中，与MALDI-TOFMS检测微生物采用的线性模式不同的是，人参皂甙Rg3的定量分析所采用的是反射模式，且待测样品的检测范围小于1000Da，同时其检测区间仅限于400-900(M/Z)，无法满足微生物的检测区间，因此受到了限制。中国专利申请2014100902157、专利技术名称“用于早期糖尿病诊断的多肽标准物”公开了一种用于质谱检测早期糖尿病的内标多肽，该多肽来源于人血清白蛋白，具有19个氨基酸序列。需要经过周期较长的孵育时间，同时该内标肽段用以参与结果判断，通过计算目标肽段与内标肽段的比值来判断罹患糖尿病的风险可能性，而非判断样品本身的检测结果是否检测准确。然而，该方法同样并非用于MALDI-TOFMS检测微生物中，其检测范围均小于1000Da，与微生物检测范围2000Da-20000Da相差较多，无法满足微生物的检测区间，因此受到了限制。作为最接近的现有技术，中国专利申请201510246677.8、专利技术名称“微生物鉴定用质谱仪分子量校正标准品及其制备方法与应用”公开了一组利用质荷比m/z分别为2094、2466、3149、4364等18条大肠杆菌特征蛋白作为标准物，以用于校正特征谱图、稳定校正效果。然而，该专利技术中涉及的标准物虽然可以有效检测微生物，但其必须在质谱检测之前进行平行检测，以对质谱仪进行分子量校正且无法直接判断单个样品检测结果的精确度，其仍然属于外部标准物，在检测过程中增加了步骤，不利于大量微生物样本的高通量、快速、便捷的检测。综上所述，目前已报道的质谱法检测样本均不能满足鉴定微生物样本时对单个样本检测的校正，其中MALDI-TOFMS法只在用于定量测定中使用添加内标的方法，而对于MALDI-TOFMS法鉴定微生物尚无报道。目前对于市场上使用MALDI-TOF-MS法检测微生物的过程中，检测范围主要是2000-20000Da(Calderaro等)，尽管有报道(Pignone等，Shah等，Kumar等，Edwards-Jones等)400-3000Da的质谱峰被用于鉴别分型等方面的研究，但该质量范围内的特征峰不被用于市售MALDI-TOF-MS仪器的鉴定。而在2000-20000Da检测范围中，微生物的主要特征峰小于12000Da(Winkler等)，因此在现有的激光质谱检测微生物的研究中，仍然使用外部标准物、甚至多种外部标准物进行校正，从而增加了检测时间和检测成本。因此，目前需要一种通过飞行时间质谱系统检测微生物特征蛋白的新方法。
技术实现思路
本专利技术原理在于：根据现有的MALDI-TOF-MS检测微生物的质荷比区间(3000-13000m/z)，首次提出使用小于3000m/z或大于12000m/z的单一内部标准物，该内部标准物具有已知的分子量和质荷比，其在微生物检测过程中并不干扰微生物特征蛋白的峰值谱图。因此，在每个待检微生物样品中均添加了该内部标准物，使其与每个微生物样品同时产生特定的质谱图，并通过该标准物的已知分子量及其对应的特征峰，来校正每个微生物样品的质谱图(例如，根据标准物的待测分子量与实际分子量的差值，为待测微生物特征蛋白的分子量测量值进行校正，如根据所述差值对实际测量值进行校正)，从而提高单个微生物样品鉴定的准确度和精密度。由于本专利技术选择的用于校正的内部标准物质选择在1000-3000Da或13000-20000Da，其不但可以达到检测效果，也在不影响微生物鉴定的基础上，添加的内部标准物质可以校正单个样品的整个谱图，以弥补MALDI-TOFMS在检测中可能造成偏差的不足。因此，本专利技术第一个目的是提供一种通过内部标准物来飞行时间质谱检测微生物的方法，该方法包括：(1)对微生物样品进行前处理；(2)在前处理的微生物样品中加入1000Da<平均分子量<3000Da或12000Da<平均分子量<20000Da的内部标准物；(3)将含有内部标准物的微生物样品进行质谱检测，使得微生物样品本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种通过试剂组合物用于飞行时间质谱系统鉴定微生物样品的内标校正方法，步骤包括：(1)用灭菌牙签(或者1μl接种环)挑取部分合适的单菌落于装有10μl组分I的离心管中，进行细胞破碎，蛋白及多肽释放，裂解5分钟；(2)取上述溶液1μl加到靶板的孔位上，室温干燥。(3)取蛋白标准品1μl覆盖到同一孔位上，自然干燥；(4)打开组分II的微管，移取1μl组分II加到同一孔位上，自然干燥；(5)靶板放入飞行时间质谱系统中进行检测，其中通过比较内部标准物的待测分子量与实际分子量的差值，为待测微生物特征蛋白的分子量进行校正；其中，该试剂组合物主要成分包括：组分I：乙腈和甲酸；组分II：乙腈，三氟乙酸和α‐氰基‐4‐羟基肉桂酸；组分Ⅲ：1000Da

【技术特征摘要】
1.一种通过试剂组合物用于飞行时间质谱系统鉴定微生物样品的内标校正方法，步骤包括：(1)用灭菌牙签(或者1μl接种环)挑取部分合适的单菌落于装有10μl组分I的离心管中，进行细胞破碎，蛋白及多肽释放，裂解5分钟；(2)取上述溶液1μl加到靶板的孔位上，室温干燥。(3)取蛋白标准品1μl覆盖到同一孔位上，自然干燥；(4)打开组分II的微管，移取1μl组分II加到同一孔位上，自然干燥；(5)靶板放入飞行时间质谱系统中进行检测，其中通过比较内部标准物的待测分子量与实际分子量的差值，为待测微生物特征蛋白的分子量进行校正；其中，该试剂组合物主要成分包括：组分I：乙腈和甲酸；组分II：乙腈，三氟乙酸和α‐氰基‐4‐羟基肉桂酸；组分Ⅲ：1000Da<平均分子量<3000Da和12000Da<平均分子量<20000Da的内部标准物，其中所述内部标准物选自1000Da<平均分子量<2000Da的多肽P(33507‐63‐0)和/或多肽P14R(syntheticpeptide)；和/或者，...

【专利技术属性】
技术研发人员：战晓微，马庆伟，宋召，谭甜霞，
申请(专利权)人：北京毅新博创生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11