本发明专利技术公开了一种评价杀虫蛋白对龟纹瓢虫成虫影响的方法及饲喂装置。本发明专利技术首先设计了一种模拟植物腺体的饲喂装置，模拟龟纹瓢虫取食棉花花外蜜腺的吸取方式，然后使用棉花汁液提取物作为溶剂溶解外源杀虫蛋白，并加入果糖作为龟纹瓢虫成虫的诱食剂；将龟纹瓢虫成虫单对放入带有饲养溶液的饲喂装置中并补充足量的豌豆蚜在光照培养箱中培养。根据待测溶液对龟纹瓢虫成虫死亡率、产卵前期、产卵量和体重的指标来判断杀虫蛋白对龟纹瓢虫成虫是否有影响。本发明专利技术建立在评价植物体内次生代谢物质与杀虫蛋白互作来影响龟纹瓢虫的风险理论之上，更加真实的反映龟纹瓢虫所面临的杀虫蛋白威胁的自然环境，且评价方法简单、适用性强。
【技术实现步骤摘要】
一种评价杀虫蛋白对龟纹瓢虫成虫影响的方法及饲喂装置
本专利技术涉及转基因植物环境安全领域，具体涉及一种外源杀虫蛋白对天敌昆虫龟纹瓢虫成虫影响的评价方法及饲喂装置。
技术介绍
苏云金芽孢杆菌为革兰氏阳性细菌属，是目前世界上应用最为广泛的微生物杀虫剂之一，它所具有的杀虫活性的主要来源是该菌株体内产生的伴孢晶体蛋白。研究人员将Bt基因导入常规作物从而获得表达外源杀虫蛋白的转基因作物，自从1996年首次种植转基因作物以来，转基因作物已在全球得到大面积推广，为全世界的农业生产创造了巨大的经济、社会及环境效益。转外源杀虫蛋白基因作物在整个生育期都能表达外源杀虫蛋白，可能会使取食转基因作物而存活下来的靶标或非靶标昆虫体内含有不同程度的外源杀虫蛋白，当天敌取食这些体内含有外源杀虫蛋白的昆虫后，外源杀虫蛋白可能会传递给天敌，并对天敌造成一定的影响。外源杀虫蛋白对天敌昆虫的安全性逐渐成为研究人员关注的重点和焦点，也是转基因抗虫植物环境安全评价的主要内容。同时转新型基因材料也不断涌现，其中导入的外源基因的环境安全性存在巨大的差异，要经过科学的评价才能进行下一步环境试验。农田天敌昆虫种类较多，其中龟纹瓢虫Propyleajaponica是优势种之一。由于它分布广，盛夏也能繁殖，在田间取食季节较长，是一种非常优良的天敌资源。龟纹瓢虫属鞘翅目、瓢虫科、龟纹瓢虫属，在我国大部分地区都有分布，捕食麦蚜、棉蚜、玉米蚜等多种蚜虫，并取食稻飞虱、木虱和叶螨等多种植食性害虫，是蚜虫及棉铃虫等害虫的优势天敌。龟纹瓢虫可以通过直接取食植食性昆虫间接暴露于外源杀虫蛋白，另外龟纹瓢虫成虫具有取食植物花外蜜腺的习性，这种习性使得龟纹瓢虫成虫具有直接暴露于外源杀虫蛋白的风险。研究结果表明，龟纹瓢虫可作为转基因作物环境安全检测中的指示性昆虫，并且建立起龟纹瓢虫规范化饲养方法，可以提供整齐一致的供试龟纹瓢虫。在评价外源杀虫蛋白对龟纹瓢虫影响时，一般以对龟纹瓢虫最大暴露量的10倍以上的外源杀虫蛋白来喂食龟纹瓢虫，直接使用转基因植物花粉无法达到上述要求。在以往评价外源杀虫蛋白对龟纹瓢虫影响时，植物体内次生代谢物质与杀虫蛋白互作来影响龟纹瓢虫的风险未被考虑。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提供了一种评价杀虫蛋白对龟纹瓢虫成虫影响的方法及饲喂装置，该方法建立在评价植物体内次生代谢物质与杀虫蛋白互作来影响龟纹瓢虫的风险理论之上，借助一种模拟植物腺体的饲喂装置来实现上述目的，更加真实的反映龟纹瓢虫所面临的杀虫蛋白威胁的自然环境，且评价方法简单、适用性强。本专利技术首先提供了一种评价外源杀虫蛋白对龟纹瓢虫成虫影响的饲喂装置，其特征是，它包括带管盖且底部开口的大离心管、带管盖的小离心管和毛细管；所述小离心管嵌套在大离心管的开口的底部，且小离心管的管体暴露在大离心管外3/4以上(管帽及上部在大离心管内)；所述毛细管的一端穿透小离心管的管盖暴露在小离心管外，另一端伸入到小离心管的底部；所述大离心管为50-100ml的离心管；所述小离心管为1-5ml的离心管；所述毛细管的内径为0.50-0.55mm。优选的，所述大离心管为50ml的离心管；所述小离心管为1.5-2.0ml的离心管；所述毛细管的内径为0.53mm。本专利技术还公开了一种评价杀虫蛋白对龟纹瓢虫成虫影响的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采集健康非转基因棉花叶片，磨碎后加入1.8-2.2倍叶片质量的无菌蒸馏水，摇床振荡提取，离心，抽取上清，过滤后即为获得的棉花汁液提取物；(2)以棉花汁液提取物作为溶剂，加入外源杀虫蛋白和果糖，制成果终浓度为0.1-0.5g/mL的待测溶液；同时设不加外源杀虫蛋白的阴性对照液以及采用蛋白酶抑制剂代替外源杀虫蛋白的阳性对照液；(3)分别将待测溶液、阳性对照液和阴性对照液装入到饲喂装置的小离心管中，盖上管盖，通过伸入到溶液底部的毛细管引流出小离心管中的溶液，截断毛细管，使溶液暴露于管口；然后将小离心管的暴露部分放置恒温装置保持蛋白活性；(4)将新羽化的龟纹瓢虫成虫根据雌雄随机配对，单对放入到饲喂装置的大离心管中，管开口处用棉花封口，连同恒温装置一起放置于光照培养箱中培养；大离心管中补充足量的豌豆蚜，每2-3天更换一次离心管中的溶液，试验持续18-25d；(5)试验过程中每天观察记录龟纹瓢虫成虫的存活和产卵情况；试验结束后，将所有存活的龟纹瓢虫成虫辨别雌雄，冷冻干燥后分别称重。进一步的，在“与阴性对照组相比，阳性对照组的成虫的发育历期显著延长，幼虫死亡率显著升高”的前提下，如果与阴性对照组相比，待测溶液对龟纹瓢虫成虫死亡率、产卵前期、产卵量和体重的指标上均没有显著性差异，则表明：外源杀虫蛋白Cry1Ac对龟纹瓢虫成虫没有造成不利影响。优选的，所述步骤(1)的摇床振荡提取为在室温下在200rpm的摇床浸取2h。优选的，所述步骤(4)光照培养箱中温度为25℃±1℃，湿度为60％-70％，光周期为L:D＝14h:10h。优选的，所述步骤(4)实验过程中，每一种饲喂溶液视为一个试验处理，每一个试验处理45对龟纹瓢虫。优选的，所述外源杀虫蛋白为Cry1Ac，其待测溶液终浓度为20μg/ml，蛋白酶抑制剂为E-64，阳性对照溶液终浓度为400μg/ml。本专利技术的有益效果是：1、本专利技术评价杀虫蛋白对龟纹瓢虫成虫影响时，完全考虑到龟纹瓢虫所面临的杀虫蛋白威胁的自然环境，具体如下：1)蚜虫取食植物棉花的叶片，龟纹瓢虫也有取食棉花的花外蜜腺的习性。本专利技术提取棉花汁液提取物作为溶剂并补充蚜虫作为饲料，不仅模拟了龟纹瓢虫取食花外蜜腺的自然环境，同时也考虑了棉花体内次生代谢物质与杀虫蛋白互作对龟纹瓢虫的影响，因此，更加真实的反映龟纹瓢虫所面临的自然环境；2)本专利技术设计了一种模拟植物腺体的装置，模拟龟纹瓢虫取食棉花的花外蜜腺的吸取方式，更加真实的反映龟纹瓢虫的取食方式。2、评价方法中要考虑龟纹瓢虫的正常存活及产卵。本专利技术采用果糖作为龟纹瓢虫成虫的诱食剂，不仅刺激龟纹瓢虫取食，还可以提高龟纹瓢虫成虫的存活率和产卵量，保证了龟纹瓢虫正常取食以及可以正常用于实验。3、本专利技术提供了一种龟纹瓢虫饲喂装置，该装置模拟植物腺体，由嵌套的大小两根离心管和毛细管构成，通过毛细管(内径0.53mm左右)引流喂食龟纹瓢虫成虫，同时还可以进一步通过恒温装置保持蛋白活性。该装置采用实验室常用化学仪器制成，结构简单且非常实用。附图说明图1为评价外源杀虫蛋白对龟纹瓢虫成虫影响的饲喂装置图；其中，1、大离心管，2、小离心管；3、毛细管。图2为饲喂装置放置于恒温装置上的图。具体实施方式下面将以实施例的方式对本专利技术作进一步的详细描述，以使本领域技术人员能够实践本专利技术。应当理解，可以采用其他实施方式，并且可以做出适当的改变而不偏离本专利技术的精神或范围。为了避免对于使本领域技术人员能够实践本专利技术来说不必要的细节，说明书可能省略了对于本领域技术人员来说已知的某些信息。因此，以下详细描述不应以限制性的意义来理解，且本专利技术的范围仅由所附权利要求界定。如图1所示，上述饲喂装置，包括带管盖且底部开口的大离心管1、带管盖的小离心管2和毛细管3。所述小离心管2嵌套在大离心管1的开口的底部，且小离心管的管体暴露在大离心管1外3/4以上(底部及下部在大离心管外，管帽及上部本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种评价外源杀虫蛋白对龟纹瓢虫成虫影响的饲喂装置，其特征是，它包括带管盖且底部开口的大离心管、带管盖的小离心管和毛细管；所述小离心管嵌套在大离心管的开口的底部，且小离心管的管体暴露在大离心管外3/4以上；所述毛细管的一端穿透小离心管的管盖暴露在小离心管外，另一端伸入到小离心管的底部；所述大离心管为50‑100ml的离心管；所述小离心管为1‑5ml的离心管；所述毛细管的内径为0.50‑0.55mm。
【技术特征摘要】
1.一种评价外源杀虫蛋白对龟纹瓢虫成虫影响的饲喂装置，其特征是，它包括带管盖且底部开口的大离心管、带管盖的小离心管和毛细管；所述小离心管嵌套在大离心管的开口的底部，且小离心管的管体暴露在大离心管外3/4以上；所述毛细管的一端穿透小离心管的管盖暴露在小离心管外，另一端伸入到小离心管的底部；所述大离心管为50-100ml的离心管；所述小离心管为1-5ml的离心管；所述毛细管的内径为0.50-0.55mm。2.如权利要求1所述的一种评价外源杀虫蛋白对龟纹瓢虫成虫影响的饲喂装置，其特征是，所述大离心管为50ml的离心管；所述小离心管为1.5-2.0ml的离心管；所述毛细管的内径为0.53mm。3.一种评价杀虫蛋白对龟纹瓢虫成虫影响的方法，其特征是，采用权利要求2所述的饲喂装置，包括以下步骤：(1)采集健康非转基因棉花叶片，磨碎后加入1.8-2.2倍叶片质量的无菌蒸馏水，摇床振荡提取，离心，抽取上清，过滤后即为获得的棉花汁液提取物；(2)以棉花汁液提取物作为溶剂，加入外源杀虫蛋白和果糖，制成果糖终浓度为0.1-0.5g/mL的待测溶液；同时设不加外源杀虫蛋白的阴性对照液以及采用蛋白酶抑制剂代替外源杀虫蛋白的阳性对照液；(3)分别将待测溶液、阳性对照液和阴性对照液装入到饲喂装置的小离心管中，盖上管盖，通过伸入到溶液底部的毛细管引流出小离心管中的溶液，截断毛细管，使溶液暴露于管口；然后将小离心管的暴露部分放置恒温装...
【专利技术属性】
技术研发人员：张帅，崔金杰，雒珺瑜，王丽，
申请(专利权)人：中国农业科学院棉花研究所，
类型：发明
国别省市：河南,41
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