一种脑组织冰冻切片的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种脑组织冰冻切片的制备方法，属于生物学、医学实验领域，包括以下步骤：(1)组织取材及固定脱水：将动物脑组织进行固定和梯度脱水；(2)冷冻预处理：用PBS溶液冲洗脑组织并拭干，修平脑组织，用锡箔纸包裹，于冰冻切片机快速制冷区域冰冻后移出，等待处理；(3)半包埋处理：将脑组织进行半包埋处理，静置1分钟；(4)冰冻切片：将样品托固定于切片机探头上，作连续冠状冰冻切片。(5)切片收集：将所需部位的切片收集于盛有冰冻保存液的6孔板内，切片于‑20℃长期保存。本发明专利技术采用半包埋处理脑组织，可避免包埋剂对脑组织的影响，切片完整齐全，无冰晶形成，免疫荧光染色良好。

【技术实现步骤摘要】
一种脑组织冰冻切片的制备方法
本专利技术涉及一种脑组织切片方法，具体涉及一种脑组织冰冻切片的制备方法。属于生物学、医学实验领域。
技术介绍
冰冻切片是借助于低温条件使组织达到一定的硬度然后切片的一种方法，能很好的保存组织的抗原和酶的活性，因而被广泛应用于临床快速病理诊断以及对于疾病的科学研究上。然而冰冻切片比石蜡切片要求高、难度大，而且冰冻切片、免疫荧光、免疫组化相较于临床病理诊断，其对技术的要求更高。影响冰冻切片制作质量的主要因素有取材、切片时的温度、包埋方式以及切片后的储存。冷冻适宜的组织块，适当的包埋方式，适当的切片，这样才能切出完好的切片。此外，取材及切片过程中要不断采取不同的措施用于避免冰晶的形成。冰冻切片是免疫组织化学中最常用的切片方法。免疫荧光标记又是最常用的标记抗原的方法。目前，实验室中冰冻切片的处理方法主要有两种。方法一：动物处死后直接冰冻组织，利用OCT包埋后放于液氮液面冷冻至包埋剂中心即将变白时取出，然后立即放于-80℃冰箱保存备用切片。由于液氮的熔点低，利用液氮直接速冻的方法容易将组织冻裂；直接冰冻组织可能会影响组织形态的完整性；方法二：动物处死后立即切取组织块，并快速投入固定液中固定，固定后再利用30％蔗糖溶液(0.1MPBS溶液)进行脱水，最后以组织块沉下为准。专利技术专利201310693067公开了一种脑组织快速冰冻切片的制备方法，利用经过丙酮作为冰冻包埋剂及液氮中间介质，使脑组织达到速冻的效果，在一定程度上减少冰晶的形成；专利技术专利201710568588公开了一种高尔基银染神经组织的冰冻切片方法，采用含甘油10％～20％V/V、含蔗糖15％～20％W/V甘油-蔗糖混合溶液对银染神经组织进行脱水处理，降低了神经组织的硬度和脆性，增强了其韧性。上述专利均采用包埋剂全包埋处理，虽然全包埋组织能够很好的保护好组织形态，但是仍存在一定的缺陷，比如：固定、脱水不完全，切片后多采用直接贴片法进行后续免疫荧光染色，此方法可造成抗体的浪费及脱片、掉片等现象，且包埋剂全包埋易造成冰晶的形成。
技术实现思路
本专利技术的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种脑组织冰冻切片的制备方法。为实现上述目的，本专利技术采用下述技术方案：一种脑组织冰冻切片的制备方法，包括以下步骤：(1)组织取材及固定脱水：使用心脏灌流取脑法取出动物脑组织，使用多聚甲醛进行固定，然后利用质量分数为10％、20％、30％蔗糖溶液进行梯度脱水；(2)冷冻预处理：将冰冻切片机和样品托提前预冷，用PBS溶液冲洗脑组织后用吸水纸拭干，修平脑组织，用锡箔纸包裹，放在冰冻切片机快速制冷区域冰冻，之后从快速制冷区域移出，等待处理；(3)半包埋处理：在样品托上浅涂一层包埋剂打底，包埋剂厚度为1mm，当包埋剂开始变白时，厚涂一层包埋剂，厚度为3mm将脑组织小心迅速放入包埋剂中，浅浅包裹脑组织底部，静置1分钟，上述操作均在冰冻切片机中进行；(4)冰冻切片：将样品托固定于切片机探头上，作连续冠状冰冻切片；(5)切片收集：将所需部位的切片收集于盛有冰冻保存液的6孔板内，每孔依次放入切片，故每一部位均可收集6套切片，且每套切片的均一性良好，切片于-20℃长期保存。优选的，步骤(1)所述组织取材及固定脱水的具体方法为：在左心室灌注4℃液体，先快速灌注生理盐水直至流出液澄清，后改为灌注质量分数为4％多聚甲醛，先快后慢，以全身僵硬为准，灌注后立即快速取出脑组织，放入提前放有4％多聚甲醛的50ml离心管中进行后固定，固定后再利用10％蔗糖，20％蔗糖，30％蔗糖(用浓度为0.1M的PBS溶液溶解)进行梯度脱水，每个梯度的蔗糖一般在室温条件下4小时到过夜，最后以脑组织沉下为准。优选的，步骤(2)所述冷冻处理的具体方法为：冰冻切片机和样品托提前预冷，切片机内温度设置为-20℃，用PBS溶液冲洗脑组织后吸水纸拭干，对脑组织进行半包埋处理，防止脑组织表面的液体冻存，防止冰晶的形成；修平脑组织，用自制锡箔纸(用于记录脑组织编号)包裹，放在冰冻切片机快速制冷区域冰冻3-5分钟，之后从快速制冷区域移出，等待处理。优选的，步骤(3)所述包埋剂为普通胶水。优选的，步骤(4)所述冰冻切片的具体方法为：将样品托固定于切片机探头上切片，在-20℃环境下作连续冠状冰冻切片，切片厚度为26微米。将上述冰冻切片用于免疫荧光染色中，步骤如下：(1)复温：将所需切片取出，室温恢复半小时。(2)漂洗：用自制挑片器将切片移入PBS中，振荡漂洗6次，每次5分钟。(3)封闭：将切片移入提前加入质量分数为1％的BSA封闭液(1ml/孔)的12孔板中，室温缓慢振荡封闭1h。(4)一抗孵育：切片移入提前加入一抗(1ml/孔)的12孔板，室温振荡孵育1h后移入4℃孵育过夜。(5)漂洗：切片小心移入PBS中，室温缓慢振荡漂洗3次，每次5分钟。(6)二抗孵育：切片小心移入提前加入二抗(1ml/孔)的12孔板中，室温缓慢振荡孵育2h，此后所有操作均在避光环境下进行。(7)漂洗：切片小心移入PBS中，室温缓慢振荡漂洗3次，每次5分钟。(8)贴片与封片：取适量PBS至载玻片，形成独立液滴，将荧光染色后的切片平铺于液滴上，用吸水纸小心吸走多余液体，自然充分晾干后滴加适量的防荧光淬灭封片剂，盖盖玻片，于激光共聚焦显微镜下观察。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的一种脑组织冰冻切片的制备方法，采用冷冻预处理的方法，拭干脑组织表面的液体，迅速冷冻脑组织，减少冰晶的形成；采用半包埋处理脑组织，可避免包埋剂对脑组织的影响，切片完整齐全，易于收集切片，便于存放切片，无冰晶形成，免疫荧光染色良好；同一脑组织可收集切片6套，可满足不同实验的需求，且均一性保持一致；最后采用冰冻切片漂片法进行免疫荧光染色方法，可使抗体孵育完全、防止脱片、掉片，而且还可以节约抗体成本。附图说明图1是半包埋处理大鼠脑组织、切片后漂片法免疫荧光染色结果图；图2是全包埋处理大鼠脑组织、切片后直接贴片免疫荧光染色结果图。图3是半包埋处理小鼠脑组织、切片后漂片法免疫荧光染色结果图；图4是全包埋处理小鼠脑组织、切片后直接贴片免疫荧光染色结果图。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本专利技术，并不对其内容进行限定。实施例1大鼠脑组织冰冻切片的制备方法及免疫荧光染色1.组织取材及固定脱水方法大鼠麻醉，在大鼠左心室灌注4℃液体，先快速灌注生理盐水直至流出液澄清，后改为灌注4％多聚甲醛，先快后慢，以全身僵硬为准，灌注后立即快速取出脑组织，放入提前放有4％多聚甲醛的50ml离心管中进行后固定，固定后再转入10％、20％、30％蔗糖溶液进行梯度脱水，每个梯度的蔗糖溶液一般在室温条件下4小时到过夜，最后以大鼠脑组织沉至管底为准。2.冷冻预处理方法冰冻切片机和样品托提前预冷，切片机内温度设置为-20℃。用PBS溶液冲洗脑组织后吸水纸拭干，防止脑组织表面的液体冻存，防止冰晶的形成；修剪多余脑组织，并修平，用自制锡箔纸(编号记录)包裹放在冰冻切片机快速制冷区域冰冻5min，之后从快速制冷区域移出，等待处理。3.半包埋处理方法(半包埋处理起到固定脑组织的作用，且切片中无包埋剂的掺杂，则可以摈弃包埋剂的干扰，减少冰晶的形成)：在样品托上浅涂(厚度本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种脑组织冰冻切片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)组织取材及固定脱水：使用心脏灌流取脑法取出动物脑组织，使用多聚甲醛进行固定，然后利用10％、20％、30％蔗糖溶液进行梯度脱水；(2)冷冻预处理：将冰冻切片机和样品托提前预冷，用PBS溶液冲洗脑组织后用吸水纸拭干，修平脑组织，用锡箔纸包裹，放在冰冻切片机快速制冷区域冰冻，之后从快速制冷区域移出，等待处理；(3)半包埋处理：在样品托上浅涂一层包埋剂打底，厚度为1mm，当包埋剂开始变白时，厚涂一层包埋剂，厚度为3mm，将脑组织小心迅速放入包埋剂中，浅浅包裹脑组织底部，上述操作均在冰冻切片机中进行。(4)冰冻切片：将样品托固定于切片机探头上，作连续冠状冰冻切片；(5)切片收集：将所需部位的切片收集于盛有冰冻保存液的6孔板内，每孔依次放入切片，每一部位均可收集6套切片，切片于‑20℃长期保存。

【技术特征摘要】
1.一种脑组织冰冻切片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)组织取材及固定脱水：使用心脏灌流取脑法取出动物脑组织，使用多聚甲醛进行固定，然后利用10％、20％、30％蔗糖溶液进行梯度脱水；(2)冷冻预处理：将冰冻切片机和样品托提前预冷，用PBS溶液冲洗脑组织后用吸水纸拭干，修平脑组织，用锡箔纸包裹，放在冰冻切片机快速制冷区域冰冻，之后从快速制冷区域移出，等待处理；(3)半包埋处理：在样品托上浅涂一层包埋剂打底，厚度为1mm，当包埋剂开始变白时，厚涂一层包埋剂，厚度为3mm，将脑组织小心迅速放入包埋剂中，浅浅包裹脑组织底部，上述操作均在冰冻切片机中进行。(4)冰冻切片：将样品托固定于切片机探头上，作连续冠状冰冻切片；(5)切片收集：将所需部位的切片收集于盛有冰冻保存液的6孔板内，每孔依次放入切片，每一部位均可收集6套切片，切片于-20℃长期保存。2.根据权利要求1所述的一种脑组织冰冻切片的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述组织取材及固定脱水的具体方法为：在动物左心室灌注4℃液体，液体为生理盐水和4％多聚甲醛溶液，先快速灌注生理盐水直至流出液澄清，后改为灌注4％多聚甲醛溶液，先快后慢，以动物全身僵硬为准，灌注后立即快速取出脑组织，放入提前放有4％多聚甲醛溶液的50ml离心管中进行后固定，固定后再利用10％、20％、30％蔗糖溶液进行梯度脱水，更换蔗糖溶液以脑组织完全下沉至管底为标准。3.根据权利要求1所述的一种脑组织冰冻切片的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述冷冻预处理的具体方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘小菊，陈丹，李宁，张美芝，高杰，王枭宇，王海娟，
申请(专利权)人：山东中医药大学，
类型：发明
国别省市：山东,37