基于CRISPR-Cas9技术提高B16F10细胞转染效率的方法技术

本发明专利技术公开了基于CRISPR‑Cas9技术提高B16F10细胞转染效率的方法。本发明专利技术首先获得特异性靶向SQSTM1基因第二外显子的sgRNA序列；其次构建SQSTM1基因的sgRNA到慢病毒载体系统，该载体表达Cas9蛋白；最后将含有该sgRNA的CRISPR/Cas9慢病毒载体转染B16F10细胞，药筛后获得SQSTM1的敲除细胞株。转染GFP质粒实验发现，所获得的SQSTM1的B16F10敲除细胞株具有转染效率明显高于未敲除细胞的优势。本发明专利技术具有操作步骤简单、sgRNA靶向性好，且对SQSTM1基因切割效率高；并能明显提高B16F10细胞的转染效率，为基础研究提供更好的细胞工具。

Method of improving B16F10 cell transfection efficiency based on CRISPR-Cas9 Technology

The invention discloses a method for improving the transfection efficiency of B16F10 cells based on CRISPR Cas9 technology. The invention firstly obtains sgRNA sequence specifically targeting the second exon of SQSTM1 gene; secondly constructs sgRNA of SQSTM1 gene into lentiviral vector system, which expresses Cas9 protein; finally transfects the CRISSR/Cas9 lentiviral vector containing the sgRNA into B16F10 cells, and obtains the knockout cell line of SQSTM1 after drug screening. Transfection efficiency of B16F10 knockout cell line of SQSTM1 was significantly higher than that of non-knockout cell line. The invention has the advantages of simple operation steps, good sgRNA targeting, high SQSTM1 gene cutting efficiency, and significantly improving the transfection efficiency of B16F10 cells, providing better cell tools for basic research.

【技术实现步骤摘要】
基于CRISPR-Cas9技术提高B16F10细胞转染效率的方法
本专利技术属于基因工程领域，更具体地说涉及基于CRISPR-Cas9技术提高B16F10细胞转染效率的方法。
技术介绍
转染是将外源核酸（包含：质粒，siRNA等）导入真核细胞中并发挥其功能的一种技术。目前转染被广泛应用于生物研究当中。然而许多生物学功能研究和涉及基因治疗的多种药物治疗受限于细胞的转染效率。B16F10细胞是一种小鼠黑色素瘤细胞株，易于培养；目前被用于小鼠体外Cas9gRNA活性验证，但目前该细胞转染效率不高，常用lipo2000脂转效率在10%左右，大大限制了后续gRNA活性验证的检测。细胞内吞作用是调节细胞摄取质粒DNA的关键过程。重要的是，内吞作用可以促进诱导自噬作为细胞对胞外DNAs进入细胞而产生的防御机制。最近的报告显示，一些转染试剂，如磷酸钙沉淀（CPPs）和脂质体（阳离子脂质），用于基因传递诱导自噬。研究显示耗尽或敲除SQSTM1可以大大提高小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）和胚胎干（ES）细胞和人宫颈癌（Hela）细胞的基因传递效率。这些数据提示敲除SQSTM1可能有助于建立新的方法提高哺乳动本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于CRISPR‑Cas9提高B16F10细胞转染效率的方法，其特征在于，首先设计获得特异性靶向SQSTM1基因第二外显子的sgRNA；其次构建SQSTM1基因的sgRNA到慢病毒载体；然后将此慢病毒载体转染B16F10细胞，药筛后得到SQSTM1基因敲除细胞株。

【技术特征摘要】
1.基于CRISPR-Cas9提高B16F10细胞转染效率的方法，其特征在于，首先设计获得特异性靶向SQSTM1基因第二外显子的sgRNA；其次构建SQSTM1基因的sgRNA到慢病毒载体；然后将此慢病毒载体转染B16F10细胞，药筛后得到SQSTM1基因敲除细胞株。2.根据权利要求1所述的特异性靶向SQSTM1基因第二外显子的sgRNA，其DNA序列如SEQIDNO.1所示，所述sgRNA在SQSTM1基因上的靶序列是唯一的。3.根据权利要求2所述的特异性靶向SQSTM1基因第二外显子的sgRNA，其引物包括：针对SQSTM1基因的靶点位于第二外显子上的引物对：SQSTM1sgRNAoligo1：如SEQIDNO.2所示；SQSTM1sgRNAoligo2：如SEQIDNO.3所示。4.根据权利要求1所述的构建SQSTM1基因的sgRNA到慢病毒载体，是一种靶向敲除SQSTM1基因的CRISPR-Cas9重组表达慢病毒载体pLenti-U6-SQSTM1spgRNAv2.0-CMV-Puro-P2A-3Flag-spCas9，其特征在于：含有特异性靶向SQSTM1基因第二外显子的sgRNA和Cas9蛋白的重组表达载体。5.根据权利要求4所述的重组表达载体的骨架载体的序列如序列表中SEQIDNO.8所示；根据权利要求1所述的CRISPR-Cas9靶向敲除B16F10细胞SQSTM1基因及其特异性的sgRNA，其特征在于包括如下步骤：(1)提供sgRNA，所述sgRNA在SQSTM1基因上的靶序列符合5’-N(19)G的序列排列规则，所述sgRNA在SQSTM1基因上的靶序列位于基因的外显子，所述sgRNA在SQSTM1基因上的靶序列位于不同的各种剪切形式的共有外显子上，所述sgRNA在SQSTM1基因上的靶序列是唯一的，并且所述sgRNA在SQSTM1上的靶位点序列如序列表SEQIDNO.1序列所示，在所述sgRNA在SQSTM1上的靶位点序列的5’-端加上ACCG序列合成得到正向寡...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨佳丽，杨兴林，潘讴东，
申请(专利权)人：和元生物技术上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31