基于RNA靶标SAT沙眼衣原体感染分子生物学检测方法技术

本发明专利技术提供了一种基于RNA靶标的SAT的沙眼衣原体感染分子生物学检测方法，包括如下步骤：步骤一，采用特异性靶标捕获技术，磁珠法提取纯净的细胞靶核酸，即RNA作为靶标，包括：(1‑1)手工提取靶标核酸特异性；(1‑2)纯净的细胞靶核酸，即RNA作为靶标；步骤二，采用RNA实时荧光恒温扩增检测技术得到沙眼衣原体感染的检测结果，包括：(2‑1)M‑MLV反转录酶产生靶标核酸RNA的一个DNA拷贝；(2‑2)T7 RNA多聚酶从DNA拷贝上产生多个RNA拷贝；(2‑3)将带有荧光标记的优化探针和提取的RNA拷贝特异结合，从而产生荧光信号由检测仪器捕获，根据信号的出现时间和强度得到沙眼衣原体感染的检测结果；步骤三，结合阳性对照和阴性对照对所述检测结果进行判定。

Molecular biological detection of Chlamydia trachomatis infection based on RNA target SAT

The present invention provides a molecular biological detection method for Chlamydia trachomatis infection based on RNA target SAT, including the following steps: step 1, using specific target capture technology, magnetic bead method to extract pure cell target nucleic acid, that is, RNA as a target, including: (1) manually extracting target nucleic acid specificity; (1_2) purified. Cell target nucleic acid, or RNA, is used as a target; step 2, real-time fluorescence thermostatic amplification of RNA is used to detect Chlamydia trachomatis infection, including: (2 1) a DNA copy of the target nucleic acid RNA produced by the M_MLV reverse transcriptase; (2 2) multiple RNA copies produced by the T7 RNA polymerase from the DNA copy; (2 3) fluorescence-carrying DNA copy. Optimized light-labeled probes and extracted RNA copies specifically bind to produce fluorescent signals captured by the detection instrument, according to the time and intensity of the signal to get the detection results of Chlamydia trachomatis infection; step 3, combined with positive and negative control to determine the results of the test.

【技术实现步骤摘要】
基于RNA靶标SAT沙眼衣原体感染分子生物学检测方法
本专利技术涉及一种细菌感染的分子生物学检测和鉴定
，尤其涉及沙眼衣原体感染的分子生物学检测和鉴定的方法。
技术介绍
衣原体是一类能通过细菌滤器、有独特发育周期、严格细胞内寄生的原核细胞型微生物，包括沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体、肺炎衣原体以及家畜衣原体四种。沙眼衣原体(chlamydialtyachomatis，CT)是沙眼、非淋菌性尿道炎、宫颈炎、盆腔炎、子宫内膜炎、新生儿包涵体结膜炎、婴儿肺炎等多种疾病的病原体，是世界上最流行的性传播性疾病的病原体。CT感染的实验室诊断主要包括，细胞生物学方法(直接镜检，分离培养)，免疫学方法(直接荧光抗体检测，酶联免疫吸附试验)和分子生物学方法。分子生物学方法现有技术通常采用的是实时荧光核酸恒温扩增检测技术(SimultaneousAmplificationandTesting，简称SAT)，该技术是将新一代的核酸恒温扩增技术和实时荧光检测技术相结合的一种新型核酸检测技术。与传统的检测方法相比具有高灵敏度、高特异性、低污染和反应稳定。关于国外病原体的检测技术，欧美疾控部门和WHO都推荐，分子诊断法作为CT检测的一种手段，是目前最为灵敏准确的方法。而且，只有分子诊断法可以检测尿液，因为采样方便，非常适用于CT的普遍筛查。在美国，恒温扩增技术(TMA)以64％的绝对优势成为主流的检测技术。国外研究表明，该技术不受标本取材的影响，取样方便，灵敏度高，特异性好，同时还可以用于用药情况的监测和判愈。对于医院而言，可提高其整体的诊疗水平，对病人而言，则避免了反复就诊，可降低诊治成本。国外市场是Gen-Probe公司的转录介导的扩增(TMA)，扩增并检测CT的rRNA。优点是每个感染细胞中有大量的rRNA，而且操作步骤简便，只是一个恒温过程，不需要变换温度的扩增仪。由于检测方法是终点检测，容易导致环境污染，国内尚无采用该法进行检测的报道。目前国内对性病CT的检测主要为胶体金和PCR。但培养的不易，胶体金检测结果的不佳，PCR的污染问题，也引发了临床对RNA检测的期盼。医院常规CT样本为尿道拭子和宫颈拭子(部分为阴道拭子)，需要专业的医务人员进行样本采集，对男性患者而言，采集样本过程痛苦。CT-SAT恒温扩增检测试剂盒是唯一获得SFDA批准的，可用于检测尿液样本的诊断试剂，灵敏度高，特异性好，并因扩增产物为RNA，可避免DNA引起的临床污染，然而其采样仍然属于侵入型，患者比较痛苦。RNA检测技术不仅可以检测尿道和宫颈拭子，而且可以检测尿液标本。以培养法为金标准，以PCR法为扩大金标准采用SAT检测男女生殖道标本的CT，拭子标本的灵敏度97.0％，特异性99.1％、准确度98.6％；首次排空尿液样本的灵敏度95.8％、特异性99.1％、准确度98.3％。尿液标本的选择，可减轻患者痛苦，减少医务人员工作量。由于RNA核酸检测技术的高灵敏度和特异性，在具备分子生物学条件的实验室，可以采用该方法常规检测应用。sanger测序是目前所有基因检测的国际金标准！sanger测序是目前所有基因检测的国际金标准，是包括荧光定量PCRTaqman探针法、普通PCR法、芯片法、二代测序法、质谱法等方法的金标准。科研领域发表基因检测相关文章，必须要有sanger测序验证数据予以支持。sanger测序之所以是目前基因检测的国际金标准，是因为sanger测序原理非常科学，过程非常缜密，结果真实可视，准确率非常高，达到99.999％。不需要建库，属于直接测序，直接读取结果，连续读取数据(不是一个点)，不需要推导结论，过程明朗数据支撑充分。这项技术是虽然经过了38年，但应用仍然广泛，还是测序的主力军，好多检测其他方法不能替代。然而，如何提取纯净的RNA作为靶标也是目前的一大难题。将现有技术的检测方法进行一个比较，参见表1，可以发现现有技术检测方法的明显的缺陷在于：操作较复杂，需有一定经验才能做好检测，且耗时长、手工操作，较复杂。表1各检测方法比较表
技术实现思路
为了克服现有技术检测方法中的以上缺陷，本申请提供了基于RNA靶标的SAT的沙眼衣原体感染分子生物学检测方法，其专利技术构思在于：通过特异性靶标捕获技术获取RNA，并与实时荧光恒温扩增检测技术(SAT)的结合将RNA靶标和SAT技术的优点有机结合，当然本专利技术的技术方案并不是两种技术应用的简单叠加，而是通过特异性靶标捕获技术，也可以称为磁珠法获得纯净的细菌靶核酸(RNA)作为精确检测沙眼衣原体感染的最重要的基础；实时荧光核酸恒温扩增检测技术使用M-MLV反转录酶、T7RNA多聚酶和优化探针技术来同时实现，从而克服了操作较复杂，需有一定经验才能做好检测，且耗时长、手工操作，较复杂的缺陷。一种基于RNA靶标的SAT的沙眼衣原体感染分子生物学检测方法，包括如下步骤：步骤一，采用特异性靶标捕获技术，即磁珠法提取纯净的细胞靶核酸，即RNA作为靶标；步骤二，采用RNA实时荧光恒温扩增检测技术得到沙眼衣原体感染的检测结果，所述RNA实时荧光恒温扩增检测技术使用反转录酶、RNA多聚酶和优化探针同时实现；步骤三，结合阳性对照和阴性对照对所述检测结果进行判定。优选的，所述步骤一包括：(1-1)手工提取靶标核酸特异性：包括在磁珠微粒表面标记oligo(dT)，在该段oligo(dT)上连接带有一段oligo(dA)的特异性的核酸捕获片段，当捕获探针与靶标核酸结合后，用磁铁吸附磁珠，即可提取靶标核酸特异性；(1-2)获取纯净的细菌靶核酸，即RNA做为靶标：包括在核酸提取的过程中，病原体裂解释放出的核酸与核酸提取液中的磁性颗粒特异结合，清洗磁性颗粒获得纯净的细菌靶核酸RNA，最大限度的将样本中的杂质去除掉，保证反应时的特异性。优选的，所述步骤二包括：(2-1)反转录酶为M-MLV反转录酶，产生靶标核酸RNA的一个DNA拷贝；(2-2)RNA多聚酶为T7RNA多聚酶，从DNA拷贝上产生多个RNA拷贝；(2-3)将带有荧光标记的优化探针和所述步骤一提取的RNA拷贝特异结合，从而产生荧光，所述荧光信号由检测仪器捕获，根据实时获得的所述荧光信号的出现时间和强度得到沙眼衣原体感染的检测结果。优选的，所述步骤三结合阳性对照和阴性对照对所述检测结果进行判定包括：应用临界弱阳性对照进行实验室质控，所设置的阳性对照、临界弱阳性对照和阴性对照的dt应满足：阳性对照dt≦临界弱阳性对照dt≦35，阴性对照dt无数值，或者为40，否则试验视为无效，重新进行，其中dt表示样本曲线与阈值曲线交点的横坐标读数。优选的，所述步骤(1-1)手工提取靶标特异性以及步骤(1-2)获取纯净的细菌靶核酸使用到磁珠分离器、电动吸引器、干式恒温仪和连续微量加样器完成。优选的，所述步骤(1-1)手工提取靶标特异性以及步骤(1-2)获取纯净的细菌靶核酸还可以通过MagX全自动核酸提取仪完成所有的提取过程，提取出来的核酸在荧光PCR仪器上进行扩增检测。新的改良后的SAT技术吸取各种技术的优势，以纯净的RNA为模板进行扩增，并进行实时检测，并且采用非侵入式样本取样，有效节约了医疗资源，并给患者带来便利，检测成本低，可受惠于更多患者，作为最新的诊断技术，具有快速、灵敏、特异、简本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于RNA靶标的SAT的沙眼衣原体感染分子生物学检测方法，其特征在于包括如下步骤：步骤一，采用特异性靶标捕获技术，即磁珠法提取纯净的细胞靶核酸，即RNA作为靶标；步骤二，采用RNA实时荧光恒温扩增检测技术得到沙眼衣原体感染的检测结果，所述RNA实时荧光恒温扩增检测技术使用反转录酶、RNA多聚酶和优化探针同时实现；步骤三，结合阳性对照和阴性对照对所述检测结果进行判定。

【技术特征摘要】
1.一种基于RNA靶标的SAT的沙眼衣原体感染分子生物学检测方法，其特征在于包括如下步骤：步骤一，采用特异性靶标捕获技术，即磁珠法提取纯净的细胞靶核酸，即RNA作为靶标；步骤二，采用RNA实时荧光恒温扩增检测技术得到沙眼衣原体感染的检测结果，所述RNA实时荧光恒温扩增检测技术使用反转录酶、RNA多聚酶和优化探针同时实现；步骤三，结合阳性对照和阴性对照对所述检测结果进行判定。2.根据权利要求1所述的一种基于RNA靶标的SAT的沙眼衣原体感染分子生物学检测方法，其特征在于所述步骤一包括：(1-1)手工提取靶标核酸特异性：包括在磁珠微粒表面标记oligo(dT)，在该段oligo(dT)上连接带有一段oligo(dA)的特异性的核酸捕获片段，当捕获探针与靶标核酸结合后，用磁铁吸附磁珠，即可提取靶标核酸特异性；(1-2)获取纯净的细菌靶核酸，即RNA做为靶标：包括在核酸提取的过程中，病原体裂解释放出的核酸与核酸提取液中的磁性颗粒特异结合，清洗磁性颗粒获得纯净的细菌靶核酸RNA，最大限度的将样本中的杂质去除掉，保证反应时的特异性。3.根据权利要求1所述的一种基于RNA靶标的SAT的沙眼衣原体感染分子生物学检测方法，其特征在于所述步骤二包括：(2-1)反转录酶为M-MLV反转录酶，产生靶标核酸RNA的一个DNA拷贝；(2-2)RNA多...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘伟，
申请(专利权)人：一零零二信息科技沧州有限责任公司，
类型：发明
国别省市：河北,13