基于3D打印的含血管及毛囊结构组织工程皮肤及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种基于3D打印的含血管及毛囊结构组织工程皮肤及其制备方法，所述组织工程皮肤由表皮层、脱细胞真皮支架和真皮层构成，表皮层以表皮干细胞作为种子细胞，与载体水凝胶复合后，通过3D打印机打印在脱细胞真皮支架的上表面，分化形成正常表皮结构，真皮层以骨髓间充质干细胞、血管内皮细胞、毛乳头细胞和脂肪干细胞作为种子细胞，与载体水凝胶复合，通过3D打印机在脱细胞真皮支架的下表面打印复合有细胞因子的明胶缓释微球，同时将种子细胞的水凝胶复合物打印在明胶缓释微球中，形成具有三维立体空间结构的真皮结构。

Tissue engineered skin containing blood vessels and hair follicles and its preparation method based on 3D printing

The invention relates to a tissue engineered skin with vascular and hair follicle structure and a preparation method thereof based on 3D printing. The tissue engineered skin is composed of epidermis layer, acellular dermal scaffold and dermal layer. The epidermis layer takes epidermal stem cells as seed cells and compounds with carrier hydrogel, and is printed in acellular true through 3D printer. The dermis is composed of bone marrow mesenchymal stem cells, vascular endothelial cells, dermal papilla cells and adipose-derived stem cells as seed cells, which are combined with carrier hydrogel. The gelatin microspheres with cytokines are printed on the lower surface of the acellular dermal scaffold by 3D printer. At the same time, the hydrogel complexes of seed cells were printed into gelatin microspheres to form dermis with three-dimensional space structure.

【技术实现步骤摘要】
基于3D打印的含血管及毛囊结构组织工程皮肤及其制备方法
本专利技术属于再生医学工程
，涉及利用组织工程方法构建的人体皮肤器官，特别是涉及通过3D打印构建的含有血管及毛囊结构的组织工程皮肤。
技术介绍
皮肤是覆盖于人体表面用以保护人体的重要器官。然而，各类疾病如大面积烧伤、手术、外伤、皮肤溃疡等均可造成皮肤损伤。对于一些面积大、程度严重的皮肤缺损，现在一般是采用自体移植方法进行治疗。但这种方法不仅会对供皮区造成新的损伤，而且经常受到自体皮肤来源有限的影响。同时，移植物还经常与移植部位存在着色泽、质地、甚至功能上的差异。组织工程是以工程学与生命科学相结合，研究开发用于组织和器官修复、改善及功能维持的生物替代物。传统的组织工程中，对受损器官的修复主要是将细胞在体外培养扩增后，附着在预先设计好的生物支架材料上，构成“细胞+支架”复合体，植入机体中相应的病损部位。随着细胞的生长繁殖，支架材料逐渐降解，最后形成具有生理功能和结构的组织或器官，从而达到组织器官修复或再生的目的。传统组织工程的局限性主要包括：(1)人体的组织和器官是由多种细胞和细胞外基质构成的，很难将这些成份同时植入到固体支架中；(2)难以在三维支架结构中精确沉积不同种类的细胞和细胞外基质；(3)受支架技术空间分辨率的限制，细胞渗透到支架材料内部的速度较慢；(4)所形成的组织或器官内无血管，氧气和养料供应不足，容易引起组织或器官坏死；(5)细胞作为构成人类器官的基本单元，其尺寸在几微米到几十微米的范围内，调控细胞分布的分辨率需控制在10μm以下，采用传统组织工程技术难以实现如此小的分辨率。因此，如何在三维尺度上精确控制不同种类细胞及细胞外基质的分布，并形成与人体组织或器官相似的三维构造体，是传统组织工程所面临的一大难题。组织工程皮肤是所有组织工程器官中发展速度最快，也是目前技术最为成熟的组织工程产品。组织工程皮肤是通过体外培养扩增大量功能细胞，复合到支架材料上，通过细胞与支架的相互作用，诱导、生长形成三维的有活性的皮肤替代物。然而，目前技术制备的组织工程皮肤距理想的永久性皮肤替代物有一定差距，尚不能在组织工程皮肤中构建出皮肤的附属器结构，如皮脂腺、汗腺等，以及组织工程能够长期存活所需要的血管。近年来，3D打印技术在制造工程领域异军突起，并开始向生物医学领域延伸。生物医学领域内的3D打印技术称作3D生物打印技术。在3D生物打印过程中，细胞(或细胞聚集体)与溶胶(水凝胶的前驱体)被同时置于打印机喷头中，由计算机控制含细胞液滴的沉积位置，在指定位置逐点打印，打印完一层继续打印另一层，层层叠加形成三维多细胞/凝胶体系，自组装形成组织或器官。3D生物打印技术保证了不同种类细胞的位置和分布的准确性，为解决传统组织工程皮肤制备问题带来了新的解决方案。细胞打印的优势主要体现在：(1)能同时构建出具有生物活性的二维或三维“多细胞/材料”体系；(2)能在时间和空间上准确沉积不同种类的细胞；(3)能构建出细胞所需的三维微环境。组织工程面临的挑战之一就是如何将细胞组装成具有血管化的组织或器官。目前虽然已经制备了一些3D打印的皮肤材料，但仍未能在皮肤材料中构建出完整的血管和毛囊等附属器官。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于3D打印的含血管及毛囊结构组织工程皮肤，以及该组织工程皮肤的制备方法。以本专利技术方法构建组织工程皮肤不仅能极大的缩短制备时间，而且制备的工程皮肤再生能力强，移植后能长期存活，排斥反应小。本专利技术所述基于3D打印的含血管及毛囊结构组织工程皮肤自上而下由表皮层、脱细胞真皮支架和真皮层构成。其中，所述的脱细胞真皮支架是将异体或异种皮经一系列处理后，脱去细胞成分，保留原有的胶原纤维成分及基本组织而得到的薄膜。以其为支架构建组织工程皮肤，其保留的基底膜结构有利于表皮分化和基膜形成，疏松的胶原结构有利于血管的长入。优选地，本专利技术所述的脱细胞真皮支架采用羊脱细胞真皮基质支架。所述表皮层是以表皮干细胞作为种子细胞，与载体水凝胶复合后，通过3D打印机打印在所述脱细胞真皮支架的上表面侧，分化形成的正常表皮结构。所述真皮层是以骨髓间充质干细胞、血管内皮细胞、毛乳头细胞和脂肪干细胞作为种子细胞，与载体水凝胶复合，通过3D打印机在所述脱细胞真皮支架的下表面侧打印复合有细胞因子的明胶缓释微球的同时，将所述种子细胞的水凝胶复合物打印在所述明胶缓释微球中，使种子细胞按人工设置的空间位置分布，均匀分布在明胶缓释微球内，形成具有理想三维立体空间结构的真皮结构。进一步地，本专利技术在所述明胶缓释微球中复合的细胞因子是促进血管生成和骨髓间充质干细胞分化的相关因子，包括血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子β(TGFβ)和肝细胞生长因子(HGF)。本专利技术中，所述作为载体的水凝胶是Ⅰ型胶原-壳聚糖凝胶复合物或Ⅰ型胶原-纤维蛋白凝胶复合物，其微观下呈蜂窝多孔结构，结构较为均一。更具体地，本专利技术是在真皮层结构中采用Ⅰ型胶原-壳聚糖凝胶复合物作为载体与所述种子细胞复合，其孔径在80～150μm范围内。在表皮层结构中则采用Ⅰ型胶原-纤维蛋白凝胶复合物作为载体与所述种子细胞复合，其孔径在10～20μm范围内。由Ⅰ型胶原-纤维蛋白组成的小孔径凝胶结构致密于真皮层水凝胶，这种不对称性能阻止真皮层个头较大的成纤维细胞向表皮层迁移，也可以防止表皮层的角质形成细胞落入成纤维细胞层面。进而，本专利技术所述的种子细胞中，表皮干细胞、毛乳头细胞、脂肪干细胞、骨髓间充质干细胞均取自自体细胞，血管内皮细胞取自于异体的脐带血管内皮。本专利技术将所述细胞因子复合在明胶缓释微球控释系统中，可以使细胞因子在一定时间内缓慢平稳的释放。以下给出了本专利技术所述基于3D打印的含血管及毛囊结构组织工程皮肤的具体制备方法。取表皮干细胞加入Ⅰ型胶原-纤维蛋白凝胶中，再加入凝血酶和4×Herps缓冲碱，搅拌均匀，形成含表皮干细胞的Ⅰ型胶原-纤维蛋白凝胶，作为表皮打印用水凝胶。将血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β和肝细胞生长因子分别加入FAD培养液中，加入明胶微球混合交联后，以等质量比混合，得到含细胞因子的明胶缓释微球。取骨髓间充质干细胞、血管内皮细胞和脂肪干细胞加入Ⅰ型胶原-壳聚糖凝胶中，再与含细胞因子的明胶缓释微球以10∶1的质量比混合，制备得到细胞-水凝胶-明胶缓释微球溶液。将毛乳头细胞用培养基稀释成1×106个/mL，制成毛乳头细胞溶液。分别将表皮打印用水凝胶、细胞-水凝胶-明胶微球溶液、毛乳头细胞溶液、含细胞因子的明胶缓释微球装入3D打印机墨盒中，制备得到各自使用的打印墨盒。在打印架上铺好脱细胞真皮支架，先使用细胞-水凝胶-明胶微球墨盒在脱细胞真皮支架上打印两层，再按照设定好的皮肤形状，同时使用细胞-水凝胶-明胶微球墨盒、毛乳头细胞墨盒、含细胞因子的明胶缓释微球墨盒进行逐层打印，形成三维多细胞/凝胶体系。真皮层打印完毕后，再铺上一层脱细胞真皮支架，将表皮打印用水凝胶逐层打印到脱细胞真皮支架上。其中，所述真皮层的平均打印厚度1.6～4mm，表皮层打印平均厚度0.2～0.4mm。本专利技术设置所述3D打印机的打印速度为1200mm/s，打印分辨率5mm。进一步地，所述Ⅰ型胶原-纤维蛋白凝胶是本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于3D打印的含血管及毛囊结构组织工程皮肤，自上而下由表皮层、脱细胞真皮支架和真皮层构成，其中，所述的脱细胞真皮支架是将异体或异种皮脱去细胞成分，保留原有胶原纤维成分及基本组织得到的薄膜；所述表皮层是以表皮干细胞作为种子细胞，与载体水凝胶复合后，通过3D打印机打印在所述脱细胞真皮支架的上表面侧，分化形成的正常表皮结构；所述真皮层是以骨髓间充质干细胞、血管内皮细胞、毛乳头细胞和脂肪干细胞作为种子细胞，与载体水凝胶复合，通过3D打印机在所述脱细胞真皮支架的下表面侧打印复合有细胞因子的明胶缓释微球的同时，将所述种子细胞的水凝胶复合物打印在所述明胶缓释微球中，形成具有三维立体空间结构的真皮结构。

【技术特征摘要】
1.基于3D打印的含血管及毛囊结构组织工程皮肤，自上而下由表皮层、脱细胞真皮支架和真皮层构成，其中，所述的脱细胞真皮支架是将异体或异种皮脱去细胞成分，保留原有胶原纤维成分及基本组织得到的薄膜；所述表皮层是以表皮干细胞作为种子细胞，与载体水凝胶复合后，通过3D打印机打印在所述脱细胞真皮支架的上表面侧，分化形成的正常表皮结构；所述真皮层是以骨髓间充质干细胞、血管内皮细胞、毛乳头细胞和脂肪干细胞作为种子细胞，与载体水凝胶复合，通过3D打印机在所述脱细胞真皮支架的下表面侧打印复合有细胞因子的明胶缓释微球的同时，将所述种子细胞的水凝胶复合物打印在所述明胶缓释微球中，形成具有三维立体空间结构的真皮结构。2.根据权利要求1所述的基于3D打印的含血管及毛囊结构组织工程皮肤，其特征是所述的脱细胞真皮支架采用羊脱细胞真皮基质支架。3.根据权利要求1所述的基于3D打印的含血管及毛囊结构组织工程皮肤，其特征是所述的细胞因子为促进血管生成和分化的相关因子，包括血管内皮生长因子，碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β和肝细胞生长因子。4.根据权利要求1所述的基于3D打印的含血管及毛囊结构组织工程皮肤，其特征是所述的水凝胶是Ⅰ型胶原-壳聚糖凝胶复合物或Ⅰ型胶原-纤维蛋白凝胶复合物。5.根据权利要求4所述的基于3D打印的含血管及毛囊结构组织工程皮肤，其特征是在真皮层结构中采用Ⅰ型胶原-壳聚糖凝胶复合物作为载体与所述种子细胞复合，在表皮层结构中则采用Ⅰ型胶原-纤维蛋白凝胶复合物作为载体与所述种子细胞复合。6.权利要求1所述基于3D打印的含血管及毛囊结构组织工程皮肤的制备方法，按照下述步骤制备：取表皮干细胞加入Ⅰ型胶原-纤维蛋白凝胶中，再加入凝血酶和4×H...

【专利技术属性】
技术研发人员：于保锋，曾思衡，傅松涛，解军，李静静，袁洋洋，姚志坚，张丽娜，王萱，马培元，田九博，穆秀丽，孟涛涛，
申请(专利权)人：山西医科大学，
类型：发明
国别省市：山西,14