本发明专利技术公开了一种用于飞行时间质谱系统微生物样本前处理的试剂组合物，该组合物能有效地裂解细菌，并以总蛋白作为靶体进行质谱检测。该试剂组合物能够得到信号强、区分度高的特征峰谱图，并对于最终鉴定分数具有更为稳定可靠的准确度。本发明专利技术还包含试剂组合物的质谱试剂盒，以及检测微生物样本的预处理方法以及检测方法。
A kit for pretreatment of microbiological samples in time-of-flight mass spectrometry system
The invention discloses a reagent composition for pretreatment of microbial samples in time-of-flight mass spectrometry system. The composition can effectively crack bacteria and perform mass spectrometry detection with total protein as a target. The reagent composition can obtain a characteristic peak spectrum with strong signal intensity and high discrimination, and has a more stable and reliable accuracy for the final identification score. The invention also relates to a mass spectrometry reagent kit comprising a reagent composition, a pretreatment method for detecting microbial samples and a detection method.
【技术实现步骤摘要】
一种飞行时间质谱系统微生物样本前处理的试剂盒
本专利技术属于生物
，涉及一种用于飞行时间质谱系统给微生物样本前处理的试剂盒及检测产品。
技术介绍
时间质谱，TimeofFlightMassSpectrometer(TOF)，是一种很常用的质谱仪，这种质谱仪的质量分析器是一个离子漂移管(iondirfttube)，由离子源产生的离子首先被收集，在收集器中所有离子速度变为0，使用一个脉冲电场加速后进入无场漂移管，并以恒定速度飞向离子接收器，离子质量越大，到达接收器所用时间越长；离子质量越小，到达接收器所用时间越短，根据这一原理，可以把不同质量的离子按m/z值大小进行分离。飞行时间质谱仪可检测的分子量范围大，扫描速度快，仪器结构简单。飞行时间质谱完成微生物样本检测的准确率可达99.9％，除了准确性高、灵活性强、通量大、检测周期短等优势外，最有吸引力的应该还是它的性价比。飞行时间质谱平台(MALDI-TOF)是国际通用的基因单核苷酸多态性(SNP)的研究平台，该方法凭借其科学性和准确性已经成为该领域的金标准。微生物种类繁多，组成复杂，并且其鉴定结果随着生长部位、生长条件和检测手段的不同而异：根据微生物的生长特性，需要进行不同方式和条件的培养，依据菌落形态和革兰染色进行初步鉴定；微生物的变异又会引起生化反应的不断变化，生化反应不典型的细菌难以鉴定；作为金标准的核酸检测方法结果准确可靠，但其技术要求高，费时，需要专门操作人员，这些方法步骤繁琐，检测周期较长，不能及时、有效地指导抗生素的应用治疗。广泛的临床经验性用药导致耐药菌株增多，进一步增加临床治疗的难度。快速鉴定临床微生物已成为亟待解决的问题。随着科学技术的发展，微生物鉴定中的染色、接种培养、生化、血清学及药敏实验等过程在不同程度上实现了自动化，大大提高了鉴定效率。此外，基于分子生物学技术的发展，出现许多快速鉴定病原微生物的方法，如:实时定量聚合酶链反应、限制性片段长度多态性分析、单链构象多态性分析、焦磷酸测序技术、荧光原位杂交、基因芯片等，例如李晓霞等人(参考文献1：《医学综述》第17卷第13期，2011年7月)报道了在临床病原菌快速鉴定技术的应用研究进展中介绍了各种检测技术在临床应用中的优缺点，这些方法无需对临床微生物进行培养分离和生化鉴定的复杂操作，具有特异性强、敏感度高、重复性好、高通量、多样性、微型化和自动化等特点，也因其检测不同细菌所需的片段特异性和长度限制及技术要求高，在临床微生物日常工作中的推广受到限制。利用质谱技术进行微生物鉴定有着明显的优点：(1)样本前期处理简单；(2)操作简单、快速、通量高；(3)灵敏度高；(4)准确度好。样本仅通过简单的蛋白提取步骤即可直接上样，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间获得图谱，然后与数据库中不同微生物家族的种/属特定图谱相比对，即可得出鉴定结果，高效迅速，且价格低廉，有着很好的临床应用潜能。然而，李晓霞等人(2011)也指出，虽然TOFMS质谱技术便能准确鉴定病原菌，为感染性疾病提供关键的治疗信息，但也存在假阴性情况，该结果可能与血培养液中细菌含量太低，不能形成特异的可识别峰有关，而且血液中的蛋白质成分对质谱的形成亦有一定的干扰，影响鉴定结果的正确性。此外，在TOFMS技术中，基质的选择直接影响样品的分析结果。迄今,有效基质的选择并没有完整的理论作为依据,只能通过对大量化合物进行试验筛选得到。通常,TOFMS采用的基质是有机酸性化合物,如用于分析多肽和蛋白质的高效基质肉桂酸衍生物HCCA和SA、芳香羧酸衍生物2,5-二羟基苯甲酸(DHB)以及测定DNA的常用基质3-羟基吡啶甲酸(3-HPA)和吡啶甲酸(PA)等，例如徐昕荣等(参考文献2：《分析科学学报》，第27卷第3期，2011)报道了分别以α-氰基-4-羟基肉桂酸、2,5-二羟基苯甲酸和芥子酸为基质，在正离子模式下对水解胶原蛋白粉分子质量分布进行测定。分析结果显示：芥子酸为最适宜基质，分析条件为线性方式和反射方式相结合，可准确、快速确定水解胶原蛋白粉的分子量分布。该方法优于其它传统的分子量测定方法。再如用于分析糖的基质有2,5-二羟基苯甲酸(2,5-DHB)、芥子酸(SA)、T-CN-4羟基肉桂酸(ACHC)等，例如郝春雁等(参考文献3：《高等学校化学学报》，1998年7月)通过糖类化合物3种常用基质MALDI-MS分析效果的比较以及寡糖和多糖正、负离子MALDI-MS谱的对比,找到了适合糖分析的基质2,5-DHB,探讨了糖类化合物激光解吸/电离条件下形成离子的过程,指出了Na+、K+离子在寡糖分子量测定中的重要作用,借助柱层析分离手段,成功地测出了分子量大于10000的葡聚糖的分子量。然而化合物具有酸性并不一定能作为有效基质的必要条件,某些碱性化合物也可作为基质。例如，周丽华等(参考文献4：《高等学校化学学报》，2004年12月)已报道的能用于分析多肽、蛋白质及DNA的碱性基质有2-氨基-4-甲基-5-硝基吡啶、2-氨基-5-硝基吡啶、对硝基苯胺和9-氨基吖啶等。碱性基质的使用能进一步扩大TOFMS的应用范围,特别是对酸敏感物质的测定。目前，用于检测微生物的TOFMS技术中，常用的基质有：α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)、2，5-二羟基苯甲酸(2，5-dihydroxybenzoicacid，DHB)、2-氨基-4-甲基-5-硝基吡啶(2-amino-4-methyl-5-nitropyridine，2a4m5n)、反式-3-吲哚丙烯酸(trans-3-indoleacrylicacid，IAA)、2-巯基苯并噻(2-mercaptobenzothiazole，MBT)、2-(4-羟基亚胺)苯甲酸[2-(4-hydroxyphenylazo)benzoicacid,HABA]、2，6-二羟乙酰苯(2，6-dihydroxyacetophenone，DHAP)、芥子酸(Sinapinicacid,3，5-dimenthoxy-4-hydroxycinnamicacid,SA)、5-氯-2-巯基苯丙噻唑(5-chloro-2-mercaptobenzothiazole，CMBT)等，例如王晔茹等(参考文献5：《卫生研究》第37卷第6期，2008)利用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对从门诊腹泻病人粪便分离的88株沙门菌进行检测分型中使用的是CHCA基质；李凤琴等(参考文献6：《中国食品卫生杂志》第19卷第5期，2007)对MALDI-TOF-MS检测食品真菌所用基质、基质与样品比例、上样方法等进行筛选,获得优化的实验条件，并对方法的重现性和实际应用进行研究。结果MALDI-TOF-MS分析不同属真菌所需的最适基质各异,红曲霉属与镰孢菌属最适基质均是MBT；曲霉属、青霉属与酵母菌的最适基质均是IAA；上样的最适基/样品比例为1：1；混合液滴干燥法为最佳上样方法。而用于配置上述基质的溶剂通常是乙腈、三氟乙酸(TFA)(王晔茹、李凤琴)，例如，为乙腈+0.1％TFA水溶液(70+30，体积分数)，或乙腈∶TFA∶水＝50：2.5：47.5或50：0.1：49.9。此外，对于市场上商售的最常见微生物前处理试剂盒V本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于飞行时间质谱微生物样本前处理的试剂组合物，其包括组分I和组分II，其中，组分I由以下组成：50.0％(v/v)的乙腈、35.0％(v/v)的甲酸，余量为水；组分II由以下组成：52.5％(v/v)的乙腈、2.5％(v/v)的三氟乙酸、15mg/ml(m/v)α‐氰基‐4‐羟基肉桂酸，余量为水，并且该组合物可将理论上落入可信区间的鉴定分数，实际上落入不可信区间、原来需要二次鉴定的不可信结果提高到可信区间，从而避免了假阴性的可能，其中可信区间即判断标准III：1.700‐1.999分，不可信区间即判断标准IV：0.000‐1.699分。
【技术特征摘要】
1.一种用于飞行时间质谱微生物样本前处理的试剂组合物，其包括组分I和组分II，其中，组分I由以下组成：50.0％(v/v)的乙腈、35.0％(v/v)的甲酸，余量为水；组分II由以下组成：52.5％(v/v)的乙腈、2.5％(v/v)的三氟乙酸、15mg/ml(m/v)α‐氰基‐4‐羟基肉桂酸，余量为水，并且该组合物可将理论上落入可信区间的鉴定分数，实际上落入不可信区间、原来需要二次鉴定的不可信结果提高到可信区间，...
【专利技术属性】
技术研发人员：马庆伟，冯立平，王杰，游胜群，
申请(专利权)人：北京毅新博创生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11
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