一种抗PRRSV的miRNA重组质粒的制备及其应用制造技术

本发明专利技术属于动物繁殖与病毒学技术领域，具体涉及一种抗PRRSV的miRNA重组质粒的制备及其应用。发明专利技术步骤如下：通过融合PCR制备猪Let‑7家族成员ssc‑let‑7a、ssc‑let‑7c、ssc‑let‑7d、ssc‑let‑7e、ssc‑let‑7f、ssc‑let‑7g、ssc‑let‑7i、ssc‑mir‑98的重组序列(该重组序列如SEQ ID NO:1所示)，构建共表达重组质粒pEGFP‑N1‑Let‑7；在细胞水平和活体水平上分别检测重组质粒对PRRSV的抑制作用。本发明专利技术为猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)的防控和药物、疫苗的制备提供了新的质粒资源。

Preparation and application of an anti PRRSV miRNA recombinant plasmid

The invention belongs to the technical field of animal reproduction and virology, in particular to the preparation and application of a microRNA recombinant plasmid against PRRSV. The steps of the invention are as follows: through the integration of PCR, the recombinant Let SSC family members of SSC, let, 7a, SSC, let, 7C, SSC, let, 7d, SSC, 7C, SSC, 7C, SSC, SSC, and 7a are constructed. 7, at the cell level and in vivo level, the inhibitory effect of recombinant plasmid on PRRSV was detected. The invention provides a new plasmid resource for the prevention and control of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRSV) and the preparation of drugs and vaccines.

【技术实现步骤摘要】
一种抗PRRSV的miRNA重组质粒的制备及其应用
本专利技术属于动物繁殖与病毒学
，具体涉及一种抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的miRNA重组质粒的制备及其应用。
技术介绍
猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染引起。PRRSV是有囊膜的单股正链RNA病毒，属动脉炎病毒科动脉炎病毒属(CavanaghD1997)。PRRSV基因组全长14.5kb，有9个开放阅读框，分别编码膜蛋白(M)、核衣壳蛋白(N)、糖基化蛋白(GPs)和非结构蛋白(Nsps)。猪繁殖与呼吸综合征主要以怀孕母猪流产及仔猪的呼吸道症状为特征，具有较高的死亡率和较低的治愈率(MurtaughMetal2002)。目前，猪繁殖与呼吸综合征仅见于猪，其他家畜未见发病。PRRS自在北美爆发以来，已席卷了世界上大部分养猪国家。2006年，在我国爆发了以高热、高发病率和高死亡率为特征的严重型PRRS，疫情给我国的生猪产业带来了灾难性的冲击，造成了巨大的经济损失。miRNA是转录后起调控作用的一类内源性非编码小RNA，通过与靶基因的3’UTR结合，抑制靶基因的翻译或导致其降解，从而实现对靶基因的调控。越来越多的研究表明miRNA在免疫细胞的发育、分化、非特异性免疫、特异性免疫应答及疾病发展中都发挥着重要的调节作用。miRNA在病毒感染和宿主天然免疫中起关键作用，参与病毒与宿主的互作，它有可能是宿主最原始的免疫方式(Agudoetal，2014)。miRNA能作为宿主的抗病毒因子，作用于病毒的RNA，显著抑制病毒复制(Lecellieretal，2005)。有研究表明mir-181能够通过体外给药的形式抑制病毒在体内复制(Guoetal，2013)。Let-7家族是目前研究最为广泛的miRNA家族之一。由Let-7a、Let-7b、Let-7c、Let-7d、Let-7e、Let-7f、Let-7g、Let-7i、及mir-98组成，广泛参与多种生物过程。有研究表明Let-7g抑制HBVpreS2蛋白的表达和病毒的复制(Takataetal2016)。此外，在猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究中，let-7g能够靶向PRRSV基因组的NSP2，抑制PRRSV在Marc-145细胞的增殖(钟瑶2013)。因此，筛选和鉴定对PRRSV感染具有重要调控功能的miRNA，分析miRNA在PRRSV感染中的作用，将加深对PRRSV感染的免疫抑制机理与其致病机理的认识，同时为研究其它动物病毒与宿主之间的相互作用机制提供新思路。另外，制备抗病毒miRNA及多个具有相似作用的miRNA重组质粒或抗miRNA寡核苷酸(anti-microRNAoligonueleotides，AMOs)也是一种理想的治疗手段(Pillaietal.,2005；Nottrottetal.,2006；Wang,2011)，有助于建立miRNA新疗法，应用于PRRSV等病毒的防治。
技术实现思路
本专利技术的目的在于分离克隆猪Let-7家族miRNAs，构建Let-7家族miRNAs表达重组质粒pEGFP-N1-Let-7，鉴定其在猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)复制中的作用，应用于PRRSV的防控等领域。本专利技术制备了猪let-7家族成员Ssc-let-7a，Ssc-let-7c，Ssc-let-7d，Ssc-let-7e，Ssc-let-7f，Ssc-let-7g，Ssc-let-7i和Ssc-mir-98的前体序列，并将其融合重组为一段长度为1686bp的核苷酸序列，该融合重组后的序列如序列表SEQIDNO:1所示本专利技术通过以下技术方案实现：1.根据猪的let-7家族成员Ssc-let-7a，Ssc-let-7c，Ssc-let-7d，Ssc-let-7e，Ssc-let-7f，Ssc-let-7g，Ssc-let-7i，和Ssc-mir-98的前体序列，按照融合PCR的原则设计如表1所述的引物(其中下划线所示的序列是所添加的酶切位点)：表1融合PCR所用的引物序列Ssc-let-7a1-F5'GAAGATCTTCTAATTCTCAGCATGTTGCTTTGTGC3'Ssc-let-7a1-R5'GGTAATCCTGGTTCTCCTGTGTAAGAAATGGTAGCTTGCCCGC3'Ssc-let-7a2-F5'GCGGGCAAGCTACCATTTCTTACACAGGAGAACCAGGATTACC3'Ssc-let-7a2-R5'CCACTGTTGCTTCAAACTCCTTGATGCTGTCTGGATGCAGATTT3'Ssc-let-7c-F5'AAATCTGCATCCAGACAGCATCAAGGAGTTTGAAGCAACAGTGG3'Ssc-let-7c-R5'TCTTGCCAGTCTTCCACTTAACGATGAAGAATTCCTCGATGGC3'Ssc-let-7d-F5'GCCATCGAGGAATTCTTCATCGTTAAGTGGAAGACTGGCAAGA3'Ssc-let-7d-R5'AGGTGGAAGGGGACAGGTAACAAGGAAACTGGTTACCGTGG3'Ssc-let-7e-F5'AGACTTGCTGCATTTTGTTTGGCTGAGGTAGGAGGTTG3'Ssc-let-7e-R5'CAAACTACTACCTCAGCCAGCTGGGGAAAGCTAGGAGGCC3'Ssc-let-7f1-F5'GGGAAACCAGGTAATGGGGAGAGAACACAGCACAGCATAAT3'Ssc-let-7f1-R5'TATCCCCACCCAACCTGTATGTGGGCTGAAGATGAACACT3'Ssc-let-7f2-F5'AGTGTTCATCTTCAGCCCACATACAGGTTGGGTGGGGATA3'Ssc-let-7f2-R5'GGCTGAGGTAGGAGGTTGAAACAAAATGCAGCAAGTCT3'Ssc-let-7g-F5'CTCTAGAAGGGCAGGAGGCATCCTCCAACGCTCCGTATCCT3'Ssc-let-7g-R5'ATTATGCTGTGCTGTGTTCTCTCCCCATTACCTGGTTTCCC3'Ssc-mir-98-F5'CCACGGTAACCAGTTTCCTTGTTACCTGTCCCCTTCCACCT3'Ssc-mir-98-R5'AGGATACGGAGCGTTGGAGGATGCCTCCTGCCCTTCTAGAG3'Ssc-let-7i-F5'GGCCTCCTAGCTTTCCCCAGCTGGCTGAGGTAGTAGTTTG3Ssc-let-7i-R5'CTGCAGAACCAATGCATCTAGCAAGGCAGTAGCTTGCGC32.以猪血液中提取基因组DNA为模板，进行PCR扩增，将扩增的前体序列通过融合PCR的方式进行两两连接，最后将融合重组产物连接到真核表达载体pEGFP-N1上，测序并进行双酶切鉴定，得到重组质粒pEGFP-N1-Let-7。3.将pEGFP-N1-Let-7重组质粒转染猪肺泡巨噬细胞(PAM)，在细胞水平上检测重组质粒对PRRSV的作用。4.将p本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.融合猪Let‑7家族成员ssc‑let‑7a、ssc‑let‑7c、ssc‑let‑7d、ssc‑let‑7e、ssc‑let‑7f、ssc‑let‑7g、ssc‑let‑7i和ssc‑mir‑98前体的重组序列，其特征在于：该重组序列如序列表SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.融合猪Let-7家族成员ssc-let-7a、ssc-let-7c、ssc-let-7d、ssc-let-7e、ssc-let-7f、ssc-let-7g、ssc-let-7i和ssc-mir-98前体的重组序列，其特征在于：该重组序列如序列表SEQIDNO:1所示。2.猪Let-7家族成员ssc-let-7a、ssc-let-7c、ssc-let-7d、ssc-let-7e、ssc-let-7f、ssc-let-7g、ssc-let-7i、ssc-mir-98的共表达重组质粒pEGFP-N1-Let-7，其特征在于：含有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。3.扩增猪Let-7家族成员ssc-let-7a、ssc-let-7c、ssc-let-7d、ssc-let-7e、ssc-let-7f、ssc-let-7g、ssc-let-7i、ssc-mir-98前体的引物组合，其特征在于：引物组合的序列如下所示：扩增ssc-let-7a的引物组合：Ssc‐let‐7a1‐FGAAGATCTTCTAATTCTCAGCATGTTGCTTTGTGC，Ssc‐let‐7a1‐RGGTAATCCTGGTTCTCCTGTGTAAGAAATGGTAGCTTGCCCGC；Ssc‐let‐7a2‐FGCGGGCAAGCTACCATTTCTTACACAGGAGAACCAGGATTACC，Ssc‐let‐7a2‐RCCACTGTTGCTTCAAACTCCTTGATGCTGTCTGGATGCAGATTT；扩增ssc-let-7c的引物组合：Ssc‐let‐7c‐FAAATCTGCATCCAGACAGCATCAAGGAGTTTGAAGCAACAGTGG，Ssc‐let‐7c‐RTCTTGCCAGTCTTCCACTTAACGATGAAGAATTCCTCGATGGC；扩增ssc-let-7d的引物组合：Ssc‐let‐7d‐FGCCATCGAGGAATTCTTCATCGTTAAGTGGAAGACTGGCAAGA，Ssc‐let‐7d‐RAGGTGGAAGGGGACAGGTAACAAGGAAACTGGTTACCGTGG；扩增ssc-let-7e的引物组合：Ssc‐let‐7e‐FAGACTTGCTGCATTTTGTTTGGCTGAGGTAGGAGGTTG...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐德全，游祥宾，刘敏，王梦侠，曲一林，高肖肖，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42