人类黄韧带干细胞的提取方法技术

本发明专利技术涉及一种人类黄韧带干细胞提取方法，该方法有以下步骤：1)取人类黄韧带组织，冲洗，剪碎；2)剪碎的组织用一型胶原酶将黄韧带消化；3)收集消化细胞，得到单细胞悬液；4)培养细胞，传代三次；5)用浓度为10μg/ml的纤连蛋白溶液筛选干细胞。该方法成本低，提取的黄韧带干细胞量大、存活率高、更易于在培养瓶内贴壁、细胞活性好。所得黄韧带干细胞纯度高，对人体无伤害，提取的黄韧带干细胞还可以为椎间盘组织工程提供一种种子细胞。

Extraction of human yellow ligament derived stem cells

The invention relates to a method for extracting human ligamentum flavum stem cells, which comprises the following steps: 1) taking human ligamentum flavum tissues, washing and cutting; 2) digesting the ligamentum flavum with a collagenase; 3) collecting digestive cells and obtaining a single cell suspension; 4) culturing cells for three passages; 5) using a fiber concentration of 10 ug/ml. The stem cells were screened by the linked protein solution. The method has the advantages of low cost, large quantity of stem cells extracted from ligamentum flavum, high survival rate, easy adherence to the culture flask and good cell activity. The obtained ligamentum flavum stem cells have high purity and no harm to human body. The extracted ligamentum flavum stem cells can also provide a seed cell for intervertebral disc tissue engineering.

【技术实现步骤摘要】
人类黄韧带干细胞的提取方法
本专利技术涉及细胞工程
，特别涉及到一种人类黄韧带干细胞分离提取方法。
技术介绍
干细胞疗法是椎间盘组织工程研究的重点。稳定获取一种足量、活性好、能够多向分化的干细胞是干细胞疗法的基础。目前，用于椎间盘组织工程研究的干细胞类型主要是骨髓间充质干细胞。获取骨髓间充质干细胞主要是购买细胞系或抽取人体骨髓提取。购买细胞系成本偏高，并且由于安全性以及伦理问题限制了购买细胞系将来的临床研究及应用。抽取骨髓提取干细胞对人体有一定伤害，并且骨髓中细胞种类繁多，干细胞纯度不能保证，提取干细胞的量也会因骨髓的量受到限制。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种人类黄韧带干细胞的提取方法，该方法成本低，提取的黄韧带干细胞量大、存活率高、更易于在培养瓶内贴壁、细胞活性好。所得黄韧带提取的干细胞纯度高，对人体无伤害，提取的黄韧带干细胞还可以为椎间盘组织工程提供一种种子细胞。本专利技术的技术方案是：人类黄韧带干细胞提取方法，有以下步骤：1)取人类黄韧带组织，冲洗，剪碎；2)剪碎的组织用一型胶原酶将黄韧带消化；3)收集消化细胞，得到单细胞悬液；4)培养细胞，传代三次；5)用浓度为10μg/ml的纤连蛋白溶液筛选干细胞。步骤1)所述冲洗，采用无菌PBS反复冲洗人类黄韧带组织直至其无血液。步骤2)所述消化在37℃孵箱恒温消化12小时，取上清，用人间充质干细胞完全培养基终止消化。步骤3)所述收集的方法是，步骤2)所述的组织消化的上清，离心，吸去上清，用人间充质干细胞完全培养基重悬细胞，形成单细胞悬液。步骤4)所述的培养是将单细胞悬液在37℃二氧化碳浓度5％条件下，人间充质干细胞完全培养基培养，至细胞融合达70～80％后，传代三次。所述传代的每次传代的方法是：用PBS液清洗两遍细胞，加入人间充质干细胞完全培养基终止消化，离心5分钟，弃上清液，再加入人间充质干细胞完全培养基重悬细胞，将一份细胞分装到3个三分容器中，进行下一次传代。步骤5)所述筛选采用浓度为10μg/ml的纤连蛋白(Sigma)溶液筛选。所述筛选的方法是：用纤连蛋白PBS溶液覆盖容器底部，4℃放置，12小时后吸去液体，用人间充质干细胞完全培养基清洗容器，吸去培养基，得到融合率已达80％的第三代细胞制得的单细胞悬液，将单细胞悬液放入纤连蛋白铺被的容器中，37℃恒温，30分钟后吸去液体，再加入人间充质干细胞完全培养基，附着在铺被有纤连蛋白的容器底部的细胞即为黄韧带干细胞。由于大多数腰椎间盘手术都需要不同程度的切除患者的黄韧带组织，因此本专利技术取材来源广泛，成本低，可以充分利用无害化处理的手术组织，同时还不会对患者造成如抽取骨髓等额外伤害。由于黄韧带组织与其他组织界限分明，因此黄韧带组织易分辨和处理，所获取的黄韧带干细胞纯度也更加高。申请人通过实验验证，采用本专利技术所述方法得到的黄韧带干细胞，其干细胞阴性标志物CD34表达量1.14％；CD45表达量1.10％。阳性标志物CD90表达量99.65％；CD105表达量87.67％。由于黄韧带干细胞增值活性高，具有多向分化能力，因此，可作为椎间盘组织工程的种子细胞。附图说明图1为采用本专利技术所述方法提取的人类黄韧带细胞形态图，其中，图1A为黄韧带原代细胞；图1B为黄韧带干细胞；图2为采用本专利技术所述方法提取人类黄韧带干细胞的流式鉴定结果图。具体实施方式1)取人类黄韧带组织，冲洗，剪碎术前与患者签订知情同意书后，在术后使用带盖子的无菌培养皿(NEST武汉博士德生物工程有限公司)收集黄韧带组织，并使用无菌生理盐水浸没组织。在无菌超净台中将获取的黄韧带组织用无菌PBS(NEST武汉博士德生物工程有限公司)冲洗干净，用镊子和剪刀除去黄韧带上其他的组织(组织必须冲洗干净，防止杂细胞影响纯度)。将冲洗后的黄韧带组织尽可能的剪碎，以保证消化完全，提高获取的细胞量。本实施例将组织剪碎到1-2mm3左右。2)消化用黄韧带组织3倍体积的3mg/ml一型胶原酶(Sigma重庆金麦生物有限公司)37℃恒温消化12小时。其中，一型胶原酶使用无血清培养基(Hyclone重庆金麦生物有限公司)配制(100mg一型胶原酶粉剂(Sigma重庆金麦生物有限公司)加入到33.3ml无血清培养基(Hyclone重庆金麦生物有限公司)中，混匀)，不能使用完全培养基或者PBS配制。完全培养基中的血清会中和掉一型胶原酶，单纯PBS不能在消化过程中的12小时里为细胞供能。之后吸取上清液，加入2ml人间充质干细胞完全培养基(Cyagen重庆金麦生物有限公司)终止消化。消化终止的时机是组织块消失形成单细胞悬液，时间与组织块大小有关，一般12小时。若组织块太大，可适当延长消化时间，但不宜超过24小时。3)收集消化细胞，得到单细胞悬液；将步骤3)消化组织的上清液1200转/分钟离心5分钟，吸去上清，用人间充质干细胞完全培养基5ml重悬细胞形成单细胞悬液。4)培养细胞，传代三次；再将5ml单细胞悬液放在25cm2培养瓶(Corning上海百赛生物技术有限公司)中使其贴壁，放置在37℃二氧化碳浓度5％孵箱中，三天换一次培养液，直至细胞融合达80％左右后传代三次。细胞融合率是指细胞覆盖培养瓶底的百分比，也就是培养瓶底的80％左右面积被细胞覆盖时。每次传代的方法是：先用PBS液清洗两遍细胞，使用胰酶将细胞消化下来，再加入人间充质干细胞完全培养基终止消化。1500转/分钟离心5分钟后吸去上清液。再加入人间充质干细胞完全培养基重悬细胞，将一瓶细胞平均分装到3个培养瓶中。5)筛选干细胞细胞包含黄韧带干细胞和其他杂细胞，可利用黄韧带干细胞容易和纤连蛋白粘附的原理将黄韧带干细胞粘附在纤连蛋白铺被的培养瓶底。具体方法是：细胞传代三次后，用浓度为10μg/ml的纤连蛋白PBS溶液3ml覆盖25cm2培养瓶瓶底，放置在4℃冰箱中。12小时后吸去液体，用3ml人间充质干细胞完全培养基轻轻清洗瓶底，吸去培养基。将25cm2培养瓶中融合率已达80％左右的第三代细胞制成3ml单细胞悬液，将单细胞悬液放入纤连蛋白铺被的培养瓶中，37℃恒温。30分钟后吸去液体，3ml人间充质干细胞完全培养基轻轻清洗瓶底，吸去培养基以去除未贴壁细胞，再加入5ml人间充质干细胞完全培养基,附着在瓶底的细胞即为黄韧带干细胞,参见图1。干细胞筛选中纤连蛋白一定要铺满瓶底以提高粘附效率。粘附时间推荐30分钟。理论上时间越短干细胞纯度越高，但粘附细胞量越少。30分钟即可保证一定纯度，又增加了粘附下来的干细胞量。6)干细胞的鉴定取第三代黄韧带干细胞制成1×10的6次方每毫升的单细胞悬液，将细胞分为实验组和对照组。实验组分别加入CD34(SantaCruz上海优宁维生物科技股份有限公司)、CD45(SantaCruz上海优宁维生物科技股份有限公司)、CD90(SantaCruz上海优宁维生物科技股份有限公司)、CD105(SantaCruz上海优宁维生物科技股份有限公司)荧光抗体2微升，对照组加入同等体积的PBS。室温避光孵育30分钟后加入2毫升PBS重悬细胞并1200rpm离心5分钟。弃上清后再次加入2毫升PBS重悬细胞并1200rpm离心5分钟，弃上清后各加入300微升PBS重悬细胞，最后上机检测，其检测结果如图2所示。结论：本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.人类黄韧带干细胞提取方法，其特征在于，有以下步骤：1)取人类黄韧带组织，冲洗，剪碎；2)剪碎的组织用一型胶原酶将黄韧带消化；3)收集消化细胞，得到单细胞悬液；4)培养细胞，传代三次；5)用浓度为10μg/ml的纤连蛋白溶液筛选干细胞。

【技术特征摘要】
1.人类黄韧带干细胞提取方法，其特征在于，有以下步骤：1)取人类黄韧带组织，冲洗，剪碎；2)剪碎的组织用一型胶原酶将黄韧带消化；3)收集消化细胞，得到单细胞悬液；4)培养细胞，传代三次；5)用浓度为10μg/ml的纤连蛋白溶液筛选干细胞。2.根据权利要求1所述的人类黄韧带干细胞提取方法，其特征在于：步骤1)所述冲洗，采用无菌PBS反复冲洗人类黄韧带组织直至其无血液。3.根据权利要求1所述的人类黄韧带干细胞提取方法，其特征在于：步骤2)所述消化在37℃孵箱恒温消化12小时，取上清，用人间充质干细胞完全培养基终止消化。4.根据权利要求1所述的人类黄韧带干细胞提取方法，其特征在于：步骤3)所述收集的方法是，步骤2)所述的组织消化的上清，离心，吸去上清，用人间充质干细胞完全培养基重悬细胞，形成单细胞悬液。5.根据权利要求1所述的人类黄韧带干细胞提取方法，其特征在于：步骤4)所述的培养是将单细胞悬液在37℃二氧化碳浓度5％条件下，人间充质干细胞完...

【专利技术属性】
技术研发人员：蓝蔚仁，孙超，韩小博，李海音，蒋长青，潘赛，李长青，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军军医大学第二附属医院，
类型：发明
国别省市：重庆,50