一种复合口腔粘膜上皮细胞的口腔补片制备方法技术

本发明专利技术公开一种复合口腔粘膜上皮细胞的口腔补片制备方法，包括以下步骤：采用粘膜下层制备口腔补片，通过传代培养法培养口腔粘膜上皮细胞，将口腔粘膜上皮细胞接种至放有口腔补片的细胞培养皿中，37℃，5%CO2细胞培养箱中培养，培养终止后即得到复合口腔粘膜上皮细胞的口腔补片。本发明专利技术所提供的一种复合口腔粘膜上皮细胞的口腔补片制备方法，材料来源充分，能够使口腔粘膜上皮细胞在口腔补片中大量增殖，为临床上口腔粘膜大面积缺损的修复重建提供新的途径。

Oral patch preparation method for composite oral epithelial cells

The invention discloses a preparation method of oral patch composed of oral mucosal epithelial cells, which comprises the following steps: preparing oral patch by submucosal layer, culturing oral mucosal epithelial cells by subculture method, inoculating oral mucosal epithelial cells into a cell culture dish containing oral patch, culturing oral mucosal epithelial cells at 37 C and 5% CO2 cells. After the culture was terminated, the oral patches of compound oral mucosal epithelial cells were obtained. The present invention provides a preparation method of oral patch composed of oral mucosal epithelial cells. The material has abundant sources, can make oral mucosal epithelial cells proliferate in large numbers in oral patch, and provides a new way for repairing and reconstructing large area oral mucosal defects in clinic.

【技术实现步骤摘要】
一种复合口腔粘膜上皮细胞的口腔补片制备方法
本专利技术涉及一种复合口腔粘膜上皮细胞的口腔补片制备方法，属于细胞生物

技术介绍
口腔粘膜作为人体生物性屏障的第一道防线，在日常生活中发挥着至关重要的作用，但口腔粘膜的位置及其周围环境导致多种因素可引起口腔粘膜组织缺失，如口腔颌面外科的肿瘤切除，创伤及修复前的牙槽外科往往有大面积口腔粘膜缺损，临床上常以皮片移植或皮瓣转移修复，但皮片移植常因挛缩导致口腔狭窄、影响功能，局部皮瓣转移则常致局部臃肿，形态不佳，患者难以接受。而且，自体组织移植是以牺牲正常组织为代价的“以创伤修复损伤”的治疗模式，既增加了新的创伤，又增加了手术并发症的机率，且自体组织来源有限，限制了其临床应用。并且对于较大面积的口腔粘膜缺损仍然具有较大的局限性，很难达到预期的治疗效果，所以寻找简便、安全、有效的口腔粘膜修复材料已成为治疗口腔粘膜疾患，提高患者生存质量的关键。随着生物材料的兴起，临床上口腔粘膜缺损修复取得较为满意的治疗效果，目前口腔粘膜缺损修复临床方法是采用在口腔粘膜修复材料种植上皮细胞后，将可降解的材料和上皮细胞缝合回患者的缺损部位，以促进患者口腔粘膜的修复。这一方法面临两大技术难点：首先原代上皮细胞贴壁效果差，同时由于人口腔黏膜组织标本来源有限导致可供增殖细胞的数量不足，在细胞培养过程中还有一定程度的细胞损伤，也是本实验中多数上皮细胞原代培养失败的重要原因。所以需要良好的细胞培养支架提高口腔粘膜上皮细胞的培养效果。组织工程学是一门新兴的学科，它应用细胞生物学和工程学的原理，研究和开发能修复损伤组织和改善其功能的生物替代物，通过少量组织细胞体外培养扩增后构建具有生命力的活体组织，达到修复组织缺损的目的。目前典型的生物可吸收材料是生物可降解的高分子聚合物分天然的和合成的两大类，其中天然高分子材料有多聚糖类（壳聚糖、透明胶质酸、藻酸盐类、淀粉）、蛋白类（胶原蛋白、丝素蛋白、）和微生物来源聚脂类（聚羟基脂肪酸脂、聚3—羟基丁酸脂）等。虽然天然高聚物具有可降解性且毒性低、但溶解或降解太快、生物性能不稳、免疫排斥及传染疾病等缺点。而合成生物可降解聚合物有聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL)、聚乙醇乙酸(PGA)等，具有细胞黏附力弱．不利于细胞附着的缺点，导致口腔上皮细胞会聚集在生物支持材料的某个区域，培养的细胞分布不均匀，所以较少作为细胞支架材料。而粘膜下层（smallintestinalsubmucosa，SIS）是天然细胞外基质类生物衍生材料，它是由一层致密的结缔组织构成，主要含有Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白，无免疫原性，具有抗微生物活性，有良好的生物力学性能和生物相容性。SIS携带多种生长因子如FGF-2、CTGF、TGF-b等，可促进多种细胞在材料上黏附、生长和分化，并能促进组织再生，是一种良好组织工程的生物支架材料。运用组织工程技术，将口腔粘膜上皮细胞作为种子细胞种植在支架材料上，构建有活性的口腔粘膜修复材料，为临床上口腔粘膜缺损修复重建提供新的途径。
技术实现思路
本专利技术所解决的技术问题是：1）口腔上皮细胞培养困难，难以获得口腔修复手术量的上皮细胞。2）口腔缺损患者因口腔颌面外科的肿瘤切除，创伤及修复前的牙槽外科手术等所造成的大面积口腔粘膜缺损，难以得到有效地修复及重建。为解决上诉技术问题，本专利技术提供了一种复合口腔粘膜上皮细胞的口腔补片制备方法，材料来源充分，同时口腔补片中含有多种生长因子，可以促进口腔粘膜上皮细胞在口腔补片中大量增殖，解决临床上口腔粘膜大面积缺损的修复重建的难题。包括以下步骤：1.口腔补片的制备：采用粘膜下层制备口腔补片。步骤为取材于粘膜下层，经去细胞、去DNA、病毒灭活、冻干和辐照灭菌等加工过程后获得；2.口腔粘膜上皮细胞的原代培养：无菌条件下于手术病人口腔内获取口腔粘膜组织。用含双抗的生理盐水反复冲洗，再用PBS液冲洗，用眼科剪除去粘膜下组织，剪成约5mm×5mm的小块，放入培养皿内，加入含0.25％DispaseⅡ的DKSFM培养基（上皮细胞无血清培养基）并没过组织块，4℃消化16～18h，将表层上皮与上皮下层用眼科镊分开；上皮层加入消化酶37℃消化15min（5min吹打振动1次），加FBS液终止消化，用吸管吹打成单细胞悬液。经200目不锈钢网过滤，离心，弃上清；PBS液清洗3次，经细胞计数后，按每毫升1×105个接种于细胞培养皿内，加入培养液3～5ml，置37℃、5%CO2饱和湿度细胞培养箱中培养，第3天开始首次换液，以后每2d换液1次；3.口腔粘膜上皮细胞的传代培养：倒置相差显微镜下观察，当口腔粘膜上皮细胞铺满培养皿底2/3以上时，弃掉旧培养液，4℃PBS清洗3次，加入消化酶37℃消化，倒置相差显微镜下见大部分细胞变圆脱壁后，加入培养液终止消化；用弯头吸管反复吹打，形成细胞悬液，离心，弃上清，加入培养液重悬细胞，经细胞计数后，按每毫升1×105个接种新培养皿内继续培养；4.口腔粘膜上皮细胞与口腔补片复合培养：取步骤1.中获得的口腔补片，放入细胞培养皿中，用DKSFM培养基浸泡1～3天后，加入6～20%的牛血清，放入37℃细胞培养箱中孵育12～16h；取步骤3.中传代培养的口腔粘膜上皮细胞，用含0.02％EDTA的消化酶消化，离心、去上清，PBS反复漂洗3次后加入培养液制成细胞悬液，将细胞悬液稀释后种至放有口腔补片的细胞培养皿中，放入37℃，5%CO2细胞培养箱中培养，每1～3天换液一次。待细胞增殖到5～10×105个/cm2时，可移植到口腔粘膜受损区，并缝合固定。口腔上皮细胞培养完成后进行DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）染色，具体步骤：在细胞增殖至一定密度后，按最终浓度100ng/ml把DAPI加入培养基中，与细胞共同孵育过夜，用PBS缓冲液漂洗至少6次以洗掉未结合的DAPI，用免疫荧光显微镜观察细胞形态。所述消化酶溶液为0.25%的胰蛋白酶溶液。步骤1.中所述的粘膜下层为小肠粘膜、胃粘膜下层、膀胱粘膜下层的一种或多种。步骤1.所述的双抗的生理盐水含100ug/ml青霉素与100ug/ml链霉素。步骤2.中所述的FBS优选为10%的FBS。所述离心过程使用的转速及时间为800rpm，5min。所述的培养液为含有10%FBS的DKSFM培养液。步骤3.中所述的细胞悬液的接种密度为2～5×106个/皿。步骤4.中所述传代培养获得的口腔粘膜上皮细胞为2代培养的细胞。步骤4.中所述口腔补片含有Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白和多种生长因子，其中生长因子为FGF-2、CTGF、TGF-b一种或多种。所述步骤1.4中所述口腔补片尺寸大小优选为5cm×4cm。本专利技术所达到的有益效果在于：1.本专利技术选择SIS作为口腔补片材料，主要由Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白具有良好的生物力学性能，抗微生物活性，良好的细胞相容性及无抗原性，能促进口腔粘膜上皮细胞的粘附、生长和分化，因此口腔粘膜上皮细胞能大量增殖形成紧密的细胞层；2.本专利技术采用口腔粘膜上皮细胞复合口腔补片，可提高大面缺损的口腔粘膜修复效率，同时提高培养口腔粘膜上皮细胞的成功率；3.本专利技术采用口腔粘膜上皮细胞复合口腔补片解决口腔缺损患者修补手术中口腔细胞难以培养的技术难题，能获得可供手术使用量的口腔上皮细胞；4.本专利技术制备的SIS补片本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种复合口腔粘膜上皮细胞的口腔补片制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1.1） 口腔补片的制备：采用粘膜下层制备口腔补片，步骤为取材于猪粘膜下层，经去细胞、去DNA、病毒灭活、冻干和辐照灭菌等加工过程后获得；1.2） 口腔粘膜上皮细胞的原代培养：用Dispase II酶消化获得手术病人口腔上皮层后，对其用消化酶消化，获得一定密度口腔上皮细胞后进行培养；1.3） 口腔粘膜上皮细胞的传代培养：对步骤1.2中获得口腔上皮细胞进行传代培养至一定代数和密度；1.4） 口腔粘膜上皮细胞与口腔补片复合培养：将步骤1.3中获得的口腔上皮细胞接种在步骤1.1中的口腔补片上，培养至特定密度，即获得复合口腔粘膜上皮细胞的口腔补片，可移植到口腔粘膜受损区，并缝合固定。

【技术特征摘要】
2017.07.11 CN 201710559545X1.一种复合口腔粘膜上皮细胞的口腔补片制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1.1）口腔补片的制备：采用粘膜下层制备口腔补片，步骤为取材于猪粘膜下层，经去细胞、去DNA、病毒灭活、冻干和辐照灭菌等加工过程后获得；1.2）口腔粘膜上皮细胞的原代培养：用DispaseII酶消化获得手术病人口腔上皮层后，对其用消化酶消化，获得一定密度口腔上皮细胞后进行培养；1.3）口腔粘膜上皮细胞的传代培养：对步骤1.2中获得口腔上皮细胞进行传代培养至一定代数和密度；1.4）口腔粘膜上皮细胞与口腔补片复合培养：将步骤1.3中获得的口腔上皮细胞接种在步骤1.1中的口腔补片上，培养至特定密度，即获得复合口腔粘膜上皮细胞的口腔补片，可移植到口腔粘膜受损区，并缝合固定。2.如权利要求1所述的口腔补片制备方法，其特征在于，粘膜下层为小肠粘膜、胃粘膜下层、膀胱粘膜下层的一种或多种。3.如权利要求1所述的口腔补片制备方法，其特征在于，所述口腔粘膜上皮细胞的原代培养步骤为：无菌条件下于手术病人口腔内获取口腔黏膜组织；用含双抗的生理盐水反复冲洗，再用PBS液冲洗；用眼科剪除去黏膜下组织，剪成约5mm×5mm的小块，放入培养皿内，加入含0.25％DispaseⅡ的DKSFM培养基并没过组织块，4℃消化16～18h，将表层上皮与上皮下层用眼科镊分开，上皮层加入消化酶37℃消化15min（5min吹打振动1次），加FBS液终止消化；用吸管吹打成单细胞悬液；经200目不锈钢网过滤，离心，弃上清，PBS液清洗3次，经细胞计数后，按每毫升1×105个细胞接种于细胞培养皿内，加入培养液3～5ml，置37℃、5%CO2饱和湿度细胞培养箱中培养，第3天开始首次换液，以后每2天换液1次。4.如权利要求1所述的口腔补片制备方法，其特征在于，所述口腔粘膜上皮细胞的传代培养步骤为：倒置相差显微镜下观察，当口腔粘膜上皮细胞铺满培养皿底2/3以上时，弃掉旧培养液；4℃PBS清...

【专利技术属性】
技术研发人员：李康乐，汪文涛，葛翠兰，
申请(专利权)人：上海白衣缘生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31