缺血性脑损伤动物模型的抗神经损伤方法技术

本发明专利技术公开了一种缺血性脑损伤动物模型的抗神经损伤方法，包括以下步骤：步骤1、缺血性脑损伤动物模型的建立方法；步骤2、进行地龙素给药实验；步骤3、进行行为学测试、梗死体积的测量，观察地龙素对缺血性脑损伤小鼠缺血半影区组织与血管新生相关的VEGF、CD34表达的影响；观察地龙素对局部脑缺血损伤小鼠PI3K‑AKT信号通路的相关因子VEGF、PI3K、AKT蛋白表达的影响。本发明专利技术通过动物实验确定了地龙素对缺血性脑损伤动物的神经保护效果的最佳剂量，通过可靠的测试指标确定了地龙素可用于缺血性脑损伤的神经保护。

Anti nerve injury method in animal models of ischemic brain injury

The invention discloses an anti-nerve injury method for an animal model of ischemic brain injury, which comprises the following steps: step 1, the establishment method of an animal model of ischemic brain injury; step 2, the administration experiment of earthworm hormone; step 3, the behavior test, the measurement of infarct volume, and the observation that earthworm hormone has little effect on ischemic brain injury. The effect of dilongsu on the expression of VEGF, CD34 related to angiogenesis in ischemic penumbra of rats was observed, and the expression of VEGF, PI3K and AKT related factors in PI3K_AKT signaling pathway was observed. The present invention determines the best dosage of earthworm hormone on the neuroprotection effect of ischemic brain injury animal by animal experiment, and confirms that earthworm hormone can be used for the neuroprotection of ischemic brain injury by reliable test index.

【技术实现步骤摘要】
缺血性脑损伤动物模型的抗神经损伤方法
本专利技术属于抗神经损伤
，尤其涉及一种缺血性脑损伤动物模型的抗神经损伤方法。
技术介绍
中风是一种常见病，多发病，死亡率和致残率都很高，目前临床上还未发现理想的治疗方法。抗血栓西药虽疗效确切，但不良反应明显，作用靶点单一且病情易反复。中药地龙具有毒副作用小，作用靶点多元等优点。目前缺血性脑损伤引起的神经损伤的治疗药物或方法并没有取得令人满意的疗效，针对这一现状，本专利技术提出了一种中药地龙素作为缺血性脑损伤的抗神经损伤药物，疗效好，克服使用西药的弊端，并能为后期研究应用多功效多靶点的药物提供科学基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种缺血性脑损伤动物模型的抗神经损伤方法，旨在解决上述
技术介绍
中提出的问题。本专利技术是这样实现的，一种缺血性脑损伤动物模型的抗神经损伤方法，包括以下步骤：步骤1、缺血性脑损伤动物模型的建立方法以6-8周龄小鼠为实验动物，实验小鼠经麻醉后，正中剪开头皮，暴露颅骨，将双面刀片黏在颅骨上，拧紧螺丝将头骨固定在自制的钢板上，以Bregma点后1mm，侧2mm为中心，将2×2mm颅骨区域磨薄头骨直至有小血管可见，尾静脉注射孟加拉红溶液，立即用绿色光束照射磨薄区域的小血管4min15sec，然后缝合头皮，用带有反馈控制的加热板保温至苏醒，放回鼠笼；步骤2、给药方法a.假手术组：给予生理盐水，每天一次，连续4周；b.经步骤1处理的模型组：给予生理盐水，每天一次，连续4周；c.经步骤1处理的模型小鼠给药组：每只小鼠以地龙素40-80mg/mL，灌胃，每天一次，连续4周；步骤3、观测指标a.观察经步骤2处理的小鼠的运动平衡能力，进行行为学测试，包括疲劳转移棒测试和前肢抓力测试；b.梗死体积的测量:将做完行为学测试的小鼠在术后72h进行腹腔麻醉，断头取脑进行TTC染色后测量梗死体积；c.观察地龙素对缺血性脑损伤小鼠缺血半影区组织与血管新生相关的VEGF、CD34表达的影响；d.观察地龙素对局部脑缺血损伤小鼠PI3K-AKT信号通路的相关因子VEGF、PI3K、AKT蛋白表达的影响。优选地，步骤2c中，所述经步骤1处理的模型小鼠给药组：每只小鼠以地龙素80mg/mL，灌胃，每天一次，连续4周。优选地，步骤3b中，所述腹腔麻醉时使用的麻醉剂为15％的氨基甲酸乙酯0.4ml。优选地，步骤3b中，所述梗死体积的计算公式为梗死体积＝对侧大脑的体积-同侧未损伤大脑的体积。本专利技术还提供了地龙素用于缺血性脑损伤的神经保护的用途。相比于现有技术的缺点和不足，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术通过建立缺血性脑损伤动物模型，并通过给药地龙素，观察地龙素对局部缺血性脑损伤小鼠行为学、脑部梗死体积的影响，分析了地龙素对局部缺血性脑损伤小鼠半影区血管密度及血管新生相关因子VEGF的影响；探讨基于血管新生信号通路VEGF/PI3K-AKT，地龙素干预后对神经细胞保护作用与VEGF、PI3K、AKT蛋白表达的相关性，本专利技术通过动物试验确定了地龙素对缺血性脑损伤动物的神经保护效果的最佳剂量，为地龙素防治中风提供实验依据。附图说明图1是本专利技术实施例提供的实验小鼠的光栓模型图。图2是本专利技术实施例提供的不同剂量的地龙素促进了实验小鼠缺血后1周内行为学功能的恢复图；图中，Sham：假手术组；Model：模型组；Lum40：40mg/mL地龙素治疗组；Lum60：60mg/mL地龙素治疗组；Lum80：80mg/mL地龙素治疗组。图3是本专利技术实施例提供的利用TTC染色评价实验小鼠缺血3天后脑组织损伤区域的大小图；图中，Sham：假手术组；Model：模型组；Lum40：40mg/mL地龙素治疗组；Lum60：60mg/mL地龙素治疗组；Lum80：80mg/mL地龙素治疗组。图4是本专利技术实施例提供的地龙素对实验小鼠局灶性脑缺血组织中VEGF和CD34表达的影响(免疫组化染色，×400)图；图中，Sham：假手术组；Model：模型组；Lum：80mg/mL地龙素治疗组。图5是本专利技术实施例提供的地龙素对PI3K-Akt信号通路的调节作用图；图中，Sham：假手术组；Model：模型组；Lum：80mg/mL地龙素治疗组。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。一种缺血性脑损伤动物模型的抗神经损伤方法，包括以下步骤：步骤1、缺血性脑损伤动物模型的建立方法以6-8周龄小鼠为实验动物，实验小鼠经氯胺酮/甲苯噻嗪(100mg/kg，15mg/mg，腹腔注射)麻醉，所用氯胺酮/甲苯噻嗪的剂量为100mg/kg，15mg/mg，采用腹腔注射麻醉，然后正中剪开头皮，暴露颅骨，将双面刀片黏在颅骨上，拧紧螺丝将头骨固定在自制的钢板上，以Bregma点后1mm，侧2mm为中心，将2×2mm颅骨区域用高速牙科转磨薄头骨直至有小血管可见，尾静脉注射孟加拉红溶液，该溶液浓度为10mg/ml，剂量按小鼠体重计为3μl/g，再立即用绿色光束照射磨薄区域的小血管4min15sec，即10x光圈的3/4，然后缝合头皮，用带有反馈控制的加热板保温至苏醒，放回鼠笼；除了未进行绿光照射外，假手术组操作过程与手术组相似。步骤2、给药方法将50只实验小鼠随机分为5组，每组10只进行如下给药实验：a.假手术组：给予生理盐水，每天一次，连续4周；b.经步骤1处理的模型组：给予生理盐水，每天一次，连续4周；c.经步骤1处理的模型小鼠给药组：每只小鼠以地龙素40mg/mL，灌胃，每天一次，连续4周；d.经步骤1处理的模型小鼠给药组：每只小鼠以地龙素60mg/mL，灌胃，每天一次，连续4周；e.经步骤1处理的模型小鼠给药组：每只小鼠以地龙素80mg/mL，灌胃，每天一次，连续4周；步骤3、观测指标a.观察经步骤2处理的小鼠的运动平衡能力，进行行为学测试，包括疲劳转移棒测试和前肢抓力测试；b.梗死体积的测量:将做完行为学测试的小鼠在术后72h用15％的氨基甲酸乙酯0.4ml进行腹腔麻醉，断头取脑进行TTC染色后测量梗死体积，红色为正常组织，白色为梗死区域，为了减少水肿对梗死体积的影响，梗死体积的计算公式为梗死体积＝对侧大脑的体积-同侧未损伤大脑的体积；c.用免疫组化法观察地龙素对缺血性脑损伤小鼠缺血半影区组织与血管新生相关的VEGF、CD34表达的影响；d.应用Western-blotting方法观察地龙素对局部脑缺血损伤小鼠PI3K-AKT信号通路的相关因子VEGF、PI3K、AKT蛋白表达的影响。4、结果分析a、缺血性脑损伤动物模型尾静脉注射孟加拉红染料后绿光照射右侧感觉运动皮层区4min15sec.，通过光激活孟加拉红后造成运动皮层区4.0×4.0mm损伤区，如图1所示，图1A为用牙科钻磨薄颅骨后显出的血管进行光照的部位；图1B为注射Rosebengal后图1A被绿光照射时显示血液凝固的图。损伤的位置分布在额部和顶部皮层。TTC染色中白色的部位是光化学栓塞诱导的梗死区域。TTC染料能够与正常细胞线粒体中的脱氢酶结合起变色反应，呈粉红色，而神经细胞功能受损后脱氢酶活性降低或失活则不能发生变色反应，显示白色本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种缺血性脑损伤动物模型的抗神经损伤方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤1、缺血性脑损伤动物模型的建立方法以6‑8周龄小鼠为实验动物，实验小鼠经麻醉后，正中剪开头皮，暴露颅骨，将双面刀片黏在颅骨上，拧紧螺丝将头骨固定在自制的钢板上，以Bregma点后1mm，侧2mm为中心，将2×2mm颅骨区域磨薄头骨直至有小血管可见，尾静脉注射孟加拉红溶液，立即用绿色光束照射磨薄区域的小血管4min 15sec，然后缝合头皮，用带有反馈控制的加热板保温至苏醒，放回鼠笼；步骤2、给药方法a.假手术组：给予生理盐水，每天一次，连续4周；b.经步骤1处理的模型组：给予生理盐水，每天一次，连续4周；c.经步骤1处理的模型小鼠给药组：每只小鼠以地龙素40‑80mg/mL，灌胃，每天一次，连续4周；步骤3、观测指标a.观察经步骤2处理的小鼠的运动平衡能力，进行行为学测试，包括疲劳转移棒测试和前肢抓力测试；b.梗死体积的测量:将做完行为学测试的小鼠在术后72h进行腹腔麻醉，断头取脑进行TTC染色后测量梗死体积；c.观察地龙素对缺血性脑损伤小鼠缺血半影区组织与血管新生相关的VEGF、CD34表达的影响；d.观察地龙素对局部脑缺血损伤小鼠PI3K‑AKT信号通路的相关因子VEGF、PI3K、AKT蛋白表达的影响。...

【技术特征摘要】
1.一种缺血性脑损伤动物模型的抗神经损伤方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤1、缺血性脑损伤动物模型的建立方法以6-8周龄小鼠为实验动物，实验小鼠经麻醉后，正中剪开头皮，暴露颅骨，将双面刀片黏在颅骨上，拧紧螺丝将头骨固定在自制的钢板上，以Bregma点后1mm，侧2mm为中心，将2×2mm颅骨区域磨薄头骨直至有小血管可见，尾静脉注射孟加拉红溶液，立即用绿色光束照射磨薄区域的小血管4min15sec，然后缝合头皮，用带有反馈控制的加热板保温至苏醒，放回鼠笼；步骤2、给药方法a.假手术组：给予生理盐水，每天一次，连续4周；b.经步骤1处理的模型组：给予生理盐水，每天一次，连续4周；c.经步骤1处理的模型小鼠给药组：每只小鼠以地龙素40-80mg/mL，灌胃，每天一次，连续4周；步骤3、观测指标a.观察经步骤2处理的小鼠的运动平衡能力，进行行为学测试，包括疲劳转移棒测试和前肢抓力测试；b.梗死体积的测量:...

【专利技术属性】
技术研发人员：李娟，李应东，陈新年，把昱萱，李茂煜，把多利，高育鹏，赵信科，
申请(专利权)人：兰州大学，
类型：发明
国别省市：甘肃,62