一种用于烟草基因编辑素材中磷酸盐的高通量连续流动分析方法技术

本发明专利技术公开了一种用于烟草基因编辑素材中磷酸盐的高通量连续流动分析方法，包括以下步骤：A、准确称取0.25g含有磷酸盐的样品置于25mL样品管中，将称好样的进样管依次放到连续流动分析仪自动进样器的进样盘上，直至全部放满；B、用移液枪向每个样品管中分别加入去离子水25mL，然后依次插入底部带有0.45μm孔径的过滤筛板的内套管，防止振荡萃取过程中溶液溅出，插好内套管后把样品盘放到振荡器上，进行振荡萃取；C、萃取完后把内套管下压，让萃取好的样品溶液通过所述过滤筛板进入到内套管中，再把样品盘放置到连续流动分析仪的自动进样器上，自动进样器的进样针每次仅插入到内套管中的上清液处以吸取过滤好的样品，转入连续流动分析仪中进行分析。

A high throughput continuous flow analysis method for phosphate in tobacco gene editing material

The invention discloses a high-throughput continuous flow analysis method for phosphate in tobacco gene editing material, which comprises the following steps: A, accurately weighing 0.25g phosphate-containing sample and placing the weighted sampling tube in a 25mL sample tube, and sequentially placing the weighted sampling tube on the sample tray of the automatic sampler of the continuous flow analyzer until all the samples are taken. B. Put 25 mL of deionized water into each sample tube with a pipette gun, and then insert the inner casing of a filter sieve plate with a diameter of 0.45 micron at the bottom to prevent the solution from splashing out in the process of oscillating extraction. After inserting the inner casing, put the sample disk on the oscillator for oscillating extraction. The extracted sample solution is put into the inner casing through the filter sieve plate, and then the sample disk is placed on the automatic sampler of the continuous flow analyzer. The sampler's sampler needle is inserted into the supernatant of the inner casing to absorb the filtered sample at each time and is transferred to the continuous flow analyzer for analysis.

【技术实现步骤摘要】
一种用于烟草基因编辑素材中磷酸盐的高通量连续流动分析方法
本专利技术属于烟草化学研究领域，具体涉及一种适合烟草基因编辑素材中磷酸盐含量检测的高通量分析方法。
技术介绍
随着烟草行业“烟草基因组计划重大专项基于基因组编辑技术的工厂化育种方案”的推进，以所有基因编辑素材为对象，通过化学成分分析对素材进行筛选，并通过烟叶的配伍性测试和卷烟配方验证，确定工业可用性强的品种，成为了烟草行业迫切需求的关键
技术实现思路
。磷是烟草重要的生命元素，不仅是核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)的重要组成成分，对光合作用、磷酸化作用和三羧酸循环等生长代谢活动起重要作用，对烟叶抗旱、抗寒、抗病能力、产量和色泽均有重要影响。因此，测定烟草中的磷酸盐有十分重要的意义。目前烟草中磷酸盐的检测常用连续流动分析法。连续流动分析技术将标准工作液、试样、试剂按比例泵入化学分析器中，并同时定时送入气体，使管路中形成连续流体分隔系统，使参与反应的物质在连续流动的过程中充分混合，然后经过一系列反应如混合、加热、过滤等，最后通过检测器检测得到相应的峰值电信号，再通过标准曲线自动计算得到相应的浓度。连续流动分析技术具有检测速度快、样品和试剂用量少等优点，在国内外烟草行业得到了广泛应用。在目前烟草常规化学成分分析的标准方法(YC/T343-2010)中，磷酸盐的测定采用去离子水萃取样品，然后再用连续流动分析仪进行测定。在样品前处理过程中，需将样品称取至磨口三角瓶中，加入萃取剂振荡萃取，用定性滤纸过滤，然后再将滤液转移至连续流动分析仪的进样管中，然后才能进行后续测定。在过滤的过程中，需将提取瓶中固体样品残渣与提取液的混合物倾倒于瓶口放置有定性滤纸折叠的漏斗中，将滤后的提取液收集在收集瓶中。样品前处理过程中需几次转移样品，不够简便，影响检测的工作效率；而且转移过程中可能会因引入杂质和提取液的不小心泼洒等影响到检测结果的可靠性。基因编辑工厂化育种至少会产生数万个编辑素材，目前磷酸盐样品分析的日样品处理量只有60个左右，完成数万个素材的常规化学成分分析需要很长周期，分析结果的滞后将会影响到整个工厂化育种的进度，因此在基因编辑育种过程中对准确可靠的高通量快速分析方法的需求非常迫切。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基因编辑素材磷酸盐测定的快速样品前处理方法，包括以下步骤：A、准确称取0.25g含有磷酸盐的样品置于25mL样品管中，从连续流动分析仪自动进样器上取下进样盘，将称好样的进样管依次放到连续流动分析仪进样盘上，直至将该进样盘中的100个样品管位全部放满样品管；B、用25mL的移液枪向每个样品管中分别加入去离子水25mL，然后依次插入底部带有0.45μm孔径的过滤筛板的内套管，防止振荡萃取过程中溶液溅出，插好内套管后把样品盘放到振荡器上，按标准方法选定的振荡萃取条件进行振荡萃取；C、萃取完后把样品管的内套管下压，让萃取好的样品溶液通过所述过滤筛板进入到内套管中，再把样品盘放置到连续流动分析仪的自动进样器上，自动进样器的进样针每次仅插入到内套管中的上清液处以吸取过滤好的样品，转入连续流动分析仪中进行分析。优选地，所述样品管顶部带有密封圈，所述内套管在振荡萃取前插入到所述密封圈内，然后加入萃取液，把内套管卡在样品管的口部防止振荡过程中萃取液溅出，但内套管底部的过滤筛板不与样品接触；样品萃取完后把内套管下压，萃取液就通过筛板过滤进入到内套管中，自动进样器可直接从内套管中抽取样品进行分析。为了减少转移工作量，专利技术人还设计了与自动进样器的样品盘匹配的振荡器，可从自动进样器上取下样品盘，装满一盘样品后直接振荡萃取，萃取完后内套管过滤，整个样品盘再放到自动进样器上进行分析。整个操作流程不需要对具体的样品进行转移，样品前处理过程得到了大大简化，样品分析效率和目前烟草行业标准方法相比可提高数倍。而且转移步骤的减少可有效防止样品前处理操作过程中的出错，大大降低了人为误差的引入。另外，常规烟草磷酸盐流动分析测定过程中，需把烟草打成细粉进行萃取，在常规方法样品前处理过程中细粉会部分糊化堵塞滤纸，过滤速度较慢，而在改进的处理方法中，振荡萃取完成后稍加放置，烟草样品粉末就沉到底下，过滤时内套管中的筛板只与上层清夜接触，这样可有效的避免过滤过程中的筛板堵塞，过滤速度更快，过滤操作更容易实现。样品分析时，按烟草行业标准YC/T269-2008(烟草及烟草制品磷酸盐的测定连续流动法)选定的条件进行测定。测定时先用硫酸钠标准溶液做工作曲线，样品按顺序摆放在自动进样器上，每隔10个样品后放一个中等浓度的标准液作为质量控制(进样频率为每两分钟1个样品)；分析工作完毕后，根据峰高从工作曲线上计算样品中磷酸盐含量。由于连续流动分析法样品取样量小，对样品的均匀性要求比常规方法高，本专利技术中试验了样品粉碎粒径对测定结果的影响，结果表明：样品不过筛，测定结果的精密度较差，随过筛目数的增加，样品测定结果的精密度增加，当目数达到60目以上时，样品测定结果的精密度趋于稳定，测定的相对标准偏差(RSD)均在1％以下，因此本专利技术中选择粉碎并过60筛。选取烤烟、白肋烟、香料烟和成品卷烟样品，分别按本专利技术的方法和烟草行业标准YC/T343-2010(烟草及烟草制品磷酸盐的测定连续流动法)进行测定，并对结果进行了比较(表1)。本专利技术方法测定结果和目前在用烟草行业标准方法测定结果无显著差异，分析结果准确可靠。表1本专利技术方法与现行标准的对比(％)本专利技术的有益效果项目组针对目前烟草中磷酸盐连续流动分析样方法中存在的不足，有针对性的设计了快速样品前处理方法。在改进分析方法中，整个操作流程不需要转移样品，样品前处理过程得到了大大简化。采用两个以上的样品盘交替处理(一盘进样、一盘前处理)，可不间断的进行分析，每天2人可处理8-10盘样品，按常规进样速度60样/h计算，每天可分析400个以上的样品，样品分析效率和目前烟草行业标准方法相比可提高数倍，并且实际样品分析结果和目前行业标准方法相符合。本专利技术为基因工厂化育种产生的海量编辑素材的高通量筛选提供了高通量快速分析方法，大大的加快了基因编辑素材筛选过程中磷酸盐分析的进程。常规烟草磷酸盐流动分析测定过程中，需把烟草打成细粉进行萃取，在常规方法样品前处理过程中细粉会部分糊化堵塞滤纸，过滤速度较慢，而在改进的处理方法中，振荡萃取完成后稍加放置，烟草样品粉末就沉到底下，过滤时内套管中的筛板只与上层清夜接触，这样可有效的避免过滤过程中的筛板堵塞，过滤速度更快，过滤操作更容易实现。附图说明图1是本专利技术中使用的进样盘。图2是本专利技术中使用的进样管以及内套管的示意图。其中a图是进样管；b图是内套管；c图为内套管插入进样管顶部时的示意图；d图为内套管向下压下的示意图；e图为内套管压到底完成原位过滤后又插入取样针吸取上清液的示意图。具体实施方式本专利技术通过以下具体实施例作进一步描述，但不限制本专利技术。实施例1：烤烟样品中磷酸盐的测定1)样品前处理：首先将烟叶(或烟丝)烘干，用高速旋风磨对烟草及烟草制品进行细胞壁破壁，然后过60目筛网，密封保存为备样。按YC/T296-2009标准测试样品含水率。按以下处理：A、准确称取0.25g含有磷酸盐的样品置于25mL样品管中，从连续流动分析仪自动进样器上取下进样本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于烟草基因编辑素材中磷酸盐的高通量连续流动分析方法，其特征在于，包括以下步骤：A、准确称取0.25g含有磷酸盐的样品置于25mL样品管中，从连续流动分析仪自动进样器上取下进样盘，将称好样的进样管依次放到连续流动分析仪进样盘上，直至将该进样盘中的100个样品管位全部放满样品管；B、用25mL的移液枪向每个样品管中分别加入去离子水25mL，然后依次插入底部带有0.45μm孔径的过滤筛板的内套管，防止振荡萃取过程中溶液溅出，插好内套管后把样品盘放到振荡器上，按标准方法选定的振荡萃取条件进行振荡萃取；C、萃取完后把样品管的内套管下压，让萃取好的样品溶液通过所述过滤筛板进入到内套管中，再把样品盘放置到连续流动分析仪的自动进样器上，自动进样器的进样针每次仅插入到内套管中的上清液处以吸取过滤好的样品，转入连续流动分析仪中进行分析。

【技术特征摘要】
1.一种用于烟草基因编辑素材中磷酸盐的高通量连续流动分析方法，其特征在于，包括以下步骤：A、准确称取0.25g含有磷酸盐的样品置于25mL样品管中，从连续流动分析仪自动进样器上取下进样盘，将称好样的进样管依次放到连续流动分析仪进样盘上，直至将该进样盘中的100个样品管位全部放满样品管；B、用25mL的移液枪向每个样品管中分别加入去离子水25mL，然后依次插入底部带有0.45μm孔径的过滤筛板的内套管，防止振荡萃取过程中溶液溅出，插好内套管后把样品盘放到振荡器上，按标准方法选定的振荡萃取条件进行振荡萃取；C、萃取完后把样品管的内套管...

【专利技术属性】
技术研发人员：许永，黄海涛，李雪梅，李晶，孔维松，王晋，刘欣，杨叶昆，张承明，向海英，曾婉俐，许力，张建铎，邓乐乐，蒋佳芮，杨光宇，
申请(专利权)人：云南中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：云南,53