The invention discloses a method for producing and purifying glucose dehydrogenase with FAD as auxiliary group, which belongs to the field of bioengineering. The invention takes Escherichia coli as host, expresses glucose dehydrogenase from Burkholderia cepacia, overfeeds and controls temperature in stages to express glucose dehydrogenase. The activity of the enzyme and glucose dehydrogenase reached 22200.0 U/L and the bacterial biomass reached 69.8 g/L. The crude enzyme solution was separated and purified by three-step chromatography, and the recombinant enzyme with specific enzyme activity of 109 U/mg was obtained. The property of the enzyme is suitable for industrial production.
【技术实现步骤摘要】
一种FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶的生产、纯化方法
本专利技术涉及一种FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶的生产、纯化方法，属于生物工程领域。
技术介绍
血糖水平作为糖尿病临床诊断的主要和常规检测指标。葡萄糖氧化酶是葡萄糖检测试剂盒或葡萄糖传感器中应用最广泛的原料用酶，但其催化活性易受溶解氧的限制，会造成测量误差。目前发现葡萄糖脱氢酶具有替代葡萄糖氧化酶的潜力，因其不以氧气为电子受体，不受溶解氧的限制，检测结果误差更小。葡萄糖脱氢酶按照辅基或辅酶类型可分为四类：(1)以NADP+为辅酶的葡萄糖六磷酸脱氢酶(EC1.1.1.49简称G6PDH)(2)以NAD+为辅酶的葡萄糖脱氢酶(EC1.1.1.47简称NAD-GDH)(3)以PQQ为辅基的葡萄糖脱氢酶(EC1.1.5.2简称PQQ-GDH)。(4)以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶(EC1.1.99.10简称FAD-GDH)。G6PDH和NAD-GDH，辅因子结合不紧密，催化过程中需要不断添加辅酶。PQQ-GDH热稳定性差，底物谱较广，除葡萄糖外还能以多种单糖和二糖为底物，限制其检测血糖的应用。FAD-GDH具有热稳定性好，催化效率...
【技术保护点】
1.一种表达FAD‑GDH的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是以大肠杆菌为宿主，表达来源于洋葱伯克霍尔德菌的葡萄糖脱氢酶。
【技术特征摘要】
1.一种表达FAD-GDH的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是以大肠杆菌为宿主，表达来源于洋葱伯克霍尔德菌的葡萄糖脱氢酶。2.根据权利要求1所述基因工程菌，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；所述葡萄糖脱氢酶的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。3.根据权利要求1-2任一所述基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的构建方法为：将核苷酸序列为SEQIDNO.2的葡萄糖脱氢酶基因连接到表达载体pTrc99A上，然后再转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，筛选正确的转化子，即得到基因工程菌BL21。4.一种利用权利要求1-2任一所述基因工程菌发酵生产FAD-GDH的方法，其特征在于，所述方法以乳糖为诱导剂，补料发酵生产FAD-GDH。5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述发酵方法的具体步骤为：(1)将基因工程接种于LB培养基，在35-39℃、150-220rpm条件下培养6-10h，得一级种子发酵液；(2)将一级种子发酵液按4-6％体积分数接种至发酵培养基中，在35-39℃、150-220rpm条件下培养6-10h，得二级种子发酵液；(3)将二级种子发酵液按体积分数8-10％的接入发酵罐分批培养；待DO值迅速上升时，溶氧迅速上升，梯度流加补料培养基。(4)菌体干重到达13-16g/L，将温度降低至28-30℃，恒速流加诱导剂诱导表达，同时控制pH在6.8-7.2，控制溶氧量在28-32％。6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述步骤(3)中梯度流加补料培养基的方法为：当菌体干重达到13-16g/L左右，开始流加补料，发酵12-14h左右，补料速度为2-4g/h；发酵14-16h左右，补料速度为5-7g/h；发酵16-1...
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