可胞外分泌菊粉内切酶的重组枯草芽孢杆菌及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种重组质粒，是使用重叠PCR将菊粉内切酶的CDS序列inuQ与信号肽重叠在一起，然后将得到的含有信号肽的片段与大肠‑枯草穿梭质粒pPsacB‑NMK连接在一起得到的。本发明专利技术还公开了一种由上述重组质粒转化枯草芽孢杆菌WB800‑R获得的可胞外分泌菊粉内切酶的重组枯草芽孢杆菌。本发明专利技术还公开了上述重组质粒和重组枯草芽孢杆菌的制备方法，以及重组枯草芽孢杆菌的应用。本发明专利技术的重组枯草芽孢杆菌不存在大肠杆菌产低聚果糖的安全隐患，在产菊粉内切酶方面比其他工程菌有更高的优势，可以获得DP3，DP4，DP5聚合度的低聚果糖，可通过一步发酵法制备低聚果糖，节省了时间，缩减了酶催化的严格条件。

Recombinant Bacillus subtilis capable of exocrine inulin endonuclease and its preparation method and Application

The invention discloses a recombinant plasmid, which is obtained by overlapping inuQ of inulin endonuclease CDS sequence with signal peptide by overlapping PCR, and then linking the obtained fragment containing signal peptide with the large intestine withered shuttle plasmid pPsacB_NMK. The invention also discloses a recombinant Bacillus subtilis which can secrete Inulinase from the above recombinant plasmid transformed into Bacillus subtilis WB800_R. The invention also discloses the preparation method of the recombinant plasmid and the recombinant Bacillus subtilis, and the application of the recombinant Bacillus subtilis. The recombinant Bacillus subtilis of the invention does not exist the potential safety hazard of producing fructooligosaccharides by E. coli, has higher advantages in producing inulin endonuclease than other engineering bacteria, can obtain fructooligosaccharides with DP3, DP4 and DP5 degree of polymerization, can be prepared by one-step fermentation method, saves time and reduces the severity of enzyme catalysis. Lattice condition.

【技术实现步骤摘要】
可胞外分泌菊粉内切酶的重组枯草芽孢杆菌及其制备方法和应用
本专利技术涉及基因工程和发酵工程
，具体涉及一种可胞外分泌菊粉内切酶的重组枯草芽孢杆菌及其制备方法和应用
技术介绍
低聚果糖分为蔗果和果果型低聚果糖，蔗果型低聚果糖是由1～3个果糖基通过β(2-1)糖苷键与蔗糖中的果糖基结合生成的蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖等的混合物；果果型低聚果糖是在菊粉内切酶的作用下，将菊粉水解成不同聚合度的低聚果糖。100克干重菊芋中约有60-70克菊粉，菊粉是通过线性的β-2，1-糖苷链连接的果聚糖，其末端为一蔗糖基。故以菊芋粉为原料用菊糖内切酶水解作用，经精制最终可得低聚果糖浆。低聚果糖是一种天然活性物质，甜度为蔗糖的0.3-0.6倍，既保持了蔗糖的纯正甜味性质，又比蔗糖甜味清爽，是具有调节肠道菌群、增殖双歧杆菌、促进钙的吸收、调节血脂、免疫调节和抗龋齿等保健功能的新型甜味剂，被誉为继抗生素时代后最具潜力的新一代添加剂——促生物质；在法国被称为原生素(PPE)，已在乳制品、乳酸菌饮料、固体饮料、糖果、饼干、面包、果冻、冷饮等多种食品中应用。低聚果糖除具有一般功能性低聚糖的物理化学性质外，最引人本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒由大肠‑枯草穿梭质粒pPsacB‑NMK与含有信号肽SP和菊粉内切酶的CDS序列inuQ的片段相连得到，所述信号肽SP为SPsacB、SPsacC、SPbpr、SPamye或SPnprb。

【技术特征摘要】
1.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒由大肠-枯草穿梭质粒pPsacB-NMK与含有信号肽SP和菊粉内切酶的CDS序列inuQ的片段相连得到，所述信号肽SP为SPsacB、SPsacC、SPbpr、SPamye或SPnprb。2.权利要求1所述的重组质粒的构建方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：1）选定霉味假单胞菌中的菊粉内切酶的CDS序列，设计并合成引物，通过PCR扩增调取菊粉内切酶的基因inuQ；所述引物序列如SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示；2）将菊粉内切酶的CDS序列inuQ与信号肽进行重叠PCR，得到含有信号肽SP的片段；所述信号肽SP为SPsacB、SPsacC、SPbpr、SPamye或SPnprb；3）表达载体pPsacB-NMK-SPinuQ的构建：以大肠-枯草穿梭质粒pPsacB-NMK为质粒骨架，利用限制性内切酶PstI和HindIII双酶切质粒pPsacB-NMK，获得双酶切质粒；4）采用一步克隆的方法将步骤2）获得的含有信号肽SP的片段与步骤3）获得的双酶切质粒连接，形成重组质粒pPsacB-NMK-SP-inuQ。3.一种可胞外分泌菊粉内切酶的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，该重组枯草芽孢杆菌由权利要求1所述的重组质粒通过转化枯草芽孢杆菌WB800-R获得；所述枯草芽孢杆菌WB800-R是在基因工程菌WB800的基础上敲除果聚糖酶SacC得到的缺陷型菌株。4.一种制备权利要求3所述的可胞外分泌菊粉内切酶的重组枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于，该方法包括：将所述重组质粒转化进所述枯草芽孢杆菌WB800-R中，通过所述重组质粒在所述枯草芽孢杆菌WB800-R中的卡纳抗性标记筛选阳性转化子，即得到所述可胞外分泌菊粉内切酶的重组枯草芽孢杆菌。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，通过化学转化法将所述重组质粒转化进枯草芽孢杆菌WB800-R中。6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述通过重组质粒在枯草芽孢杆菌W...

【专利技术属性】
技术研发人员：高健，姜瑞凡，徐虹，黄巍巍，张丽，薛锋，倪浩，梅笛芬，张红，
申请(专利权)人：盐城工学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32