利用lncRNA-mRNA共表达网络预测三阴乳腺癌纺锤体组装检查点异常的方法技术

本发明专利技术涉及一种利用lncRNA‑mRNA共表达网络预测三阴乳腺癌纺锤体组装检查点异常的方法，包括以下步骤：实验分组、RNA提取、lncRNA芯片数据差异性表达分析、以及lncRNA靶基因分析及调控网络构建。本发明专利技术的利用lncRNA‑mRNA共表达网络预测三阴乳腺癌纺锤体组装检查点异常的方法，通过lnRNA‑mRNA共表达网络预测纺锤体组装检查点异常为发现三阴乳腺癌新的分子标志物提供了新途径，为预测三阴乳腺癌预后提供了参考依据。

Prediction of abnormal spindle checkpoint in three yin breast cancer using lncRNA-mRNA coexpression network

The present invention relates to a method for predicting spindle assembly checkpoint abnormalities in triple-negative breast cancer using lncRNA_mRNA co-expression network, including the following steps: experimental grouping, RNA extraction, analysis of differential expression of lncRNA chip data, and analysis of lncRNA target genes and construction of regulatory network. The method of using lncRNA_mRNA co-expression network to predict spindle assembly checkpoint abnormalities of triple-negative breast cancer and predicting spindle assembly checkpoint abnormalities through lncRNA_mRNA co-expression network provide a new way to discover new molecular markers of triple-negative breast cancer, and provide a reference basis for predicting the prognosis of triple-negative breast cancer.

【技术实现步骤摘要】
利用lncRNA-mRNA共表达网络预测三阴乳腺癌纺锤体组装检查点异常的方法
本专利技术涉及lncRNA-mRNA共表达网络，特别涉及一种利用lncRNA-mRNA共表达网络预测三阴乳腺癌纺锤体组装检查点异常的方法。
技术介绍
三阴乳腺癌(Triple-negativebreastcancer,TNBC)是乳腺癌中侵袭性最强的一种亚型，约占全部乳腺癌的20％。TNBC即雌激素受体(Estrogenreceptor,ER)、孕激素受体(Progesteronereceptor,PR)和人表皮生长因子受体2(Humanepidermalgrowthfactorreceptor2,Her-2)皆表达缺失的乳腺癌。现在临床上针对TNBC的全身治疗方式仍然主要为蒽环类药物阿霉素(Doxorubicin,DOX)、表柔比星(Epirubicin,EPI)及吡柔比星(Pirarubicin,THP)等细胞毒药物为主。目前认为，TNBC其预后差的原因与其生物学特性和缺乏有效的监测治疗手段有关。纺锤体检查点(spindleassemblyCheckpoint,SAC)是在细胞有丝分裂期保证染色体正确分离的重要监控机制，维持着基因组稳定性。许多肿瘤细胞存在纺锤体检查点功能缺陷,纺锤体检查点表达量的失调、基因单核苷酸多态性及启动子甲基化等可能与其功能异常有关。抗肿瘤药物通过影响纺锤体检查点的表达而启动杀伤肿瘤效应。深入了解肿瘤纺锤体检查点调控机制，有助于发现新的杀灭肿瘤细胞的靶向化疗药物。
技术实现思路
本专利技术要解决现有技术中的技术问题，提供一种利用lncRNA-mRNA共表达网络预测三阴乳腺癌纺锤体组装检查点异常的方法。为了解决上述技术问题，本专利技术的技术方案具体如下：一种利用lncRNA-mRNA共表达网络预测三阴乳腺癌纺锤体组装检查点异常的方法，包括以下步骤：步骤1：实验分组用吡柔比星处理人乳腺癌细胞，建立test组；以未进行吡柔比星处理的人乳腺癌细胞，建立con组；步骤2：RNA提取提取test组和con组中人乳腺癌细胞的lncRNA和mRNA；步骤3：lncRNA芯片数据差异性表达分析(1)导入每个lncRNA探针的预设值；(2)过滤掉在所有芯片的重复探针中Flag均为“-50”的lncRNA探针；(3)将每张芯片所含重复探针的荧光强度值取中位数；(4)计算每张芯片中重复探针的变异系数值；(5)芯片间采用Invariantset标准化法进行数据均一化，在同样本重复探针中取平均值；(6)依据实验设计和分组情况对lncRNA探针进行对比，计算|FC|>2差异倍数；(7)差异基因列表：选取满足|FC|>2，P<0.05的基因为差异基因；(8)主成分和聚类分析：芯片讯号值经数据log转换及平均数中心化后，依需求筛选出适当数目的差异基因以平均连接算法进行聚类分析；步骤4：lncRNA靶基因分析及调控网络构建利用Targetscan数据库对lncRNA靶基因进行初步预测；利用DAVID数据库将mRNA靶基因进行KEGG通路富集分析，筛选出P＜0.05的基因通路。在上述技术方案中，步骤1中的分组具体为：test组：5μM吡柔比星处理的人乳腺癌细胞组，每组3个生物学重复；con组：人乳腺癌细胞组，每组3个生物学重复。在上述技术方案中，步骤2具体包括以下步骤：(1)将生长在6cm平皿中至对数期的细胞移除培养液，PBS洗涤2次并弃去；(2)向平皿中加入1～2mLTrizol试剂，用移液器反复吹打细胞层并收集至离心管中；(3)向离心管中加入200～500μL三氯甲烷，上下充分震荡至液体完全乳化；室温静置5min；12000rpm、4℃离心15min；(4)收集上层无色液体至另一离心管中，加入等体积异丙醇，上下充分混匀；室温静置10min；12000rpm、4℃离心10min；(5)弃去上清液，避免接触到底部沉淀，沿管壁加入1mL75％乙醇溶液；转动离心管至液体充分润湿管壁；12000rpm、4℃离心5min；(6)弃去上清液，避免接触到底部沉淀；将离心管放入超净台中，风干至底部沉淀透明；加入10～20μL的无核酸酶水溶解沉淀；-80℃保存。在上述技术方案中，步骤4还包括以下步骤：进一步筛选出与肿瘤相关通路，并按可被lncRNA调控的数量进行排序；将进一步筛选的通路相关靶基因进行整合，得到吡柔比星干预下的lncRNA的靶基因及lncRNA-mRNA共表达基因；筛选差异表达的lncRNA和mRNA，筛选条件为|FC|>2，P<0.05。本专利技术具有以下的有益效果：本专利技术的利用lncRNA-mRNA共表达网络预测三阴乳腺癌纺锤体组装检查点异常的方法，通过lnRNA-mRNA共表达网络预测纺锤体组装检查点异常为发现三阴乳腺癌新的分子标志物提供了新途径，为预测三阴乳腺癌预后提供了参考依据。附图说明下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细说明。图1为test组与con组差异基因统计柱状图，图中左侧为上调的基因数量，右侧为下调的基因数量。具体实施方式本专利技术的利用lncRNA-mRNA共表达网络预测三阴乳腺癌纺锤体组装检查点异常的方法，包括以下步骤：步骤1：实验分组用吡柔比星(THP)处理人乳腺癌MDA-MB-231细胞，建立test组(测试组)和con组(对比组)。test组：5μMTHP中处理MDA-MB-231组，每组3个生物学重复；con组：MDA-MB-231组，每组3个生物学重复。步骤2：RNA提取(1)将生长在6cm平皿中至对数期的细胞移除培养液，PBS洗涤2次并弃去。(2)向平皿中加入1～2mLTrizol试剂，用移液器反复吹打细胞层并收集至离心管中。(3)向离心管中加入200～500μL三氯甲烷，上下充分震荡至液体完全乳化。室温静置5min。12000rpm(～13400×g)、4℃离心15min。(4)收集上层无色液体至另一离心管中，加入等体积异丙醇，上下充分混匀。室温静置10min。12000rpm(～13400×g)、4℃离心10min。(5)小心弃去上清液，避免接触到底部沉淀，沿管壁缓缓加入1mL75％乙醇溶液。轻轻转动离心管至液体充分润湿管壁。12000rpm(～13400×g)、4℃离心5min。(6)小心弃去上清液，避免接触到底部沉淀。将离心管放入超净台中，风干至底部沉淀透明。加入10～20μL的无核酸酶水(Nuclease-FreeWater)溶解沉淀即可。-80℃保存。步骤3：lncRNA芯片数据差异性表达分析(1)将GPR文档加载到R2.12.1版本软件中进行数据运算，导入GPR文档中每个探针的“前景值”(预设值)。(2)过滤掉在所有芯片的重复探针中Flag均为“-50”的探针。(3)将每张芯片所含重复探针的荧光强度值取中位数。(4)计算每张芯片中重复探针的CV值(coefficientvariance,变异系数)。(5)芯片间采用Invariantset标准化法(invariantsetnormalizationmethod)进行数据均一化，在同样本重复探针中取平均值。(6)依据实验设计和分组情况对lncRNA探针进行对比，计算|FC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用lncRNA‑mRNA共表达网络预测三阴乳腺癌纺锤体组装检查点异常的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：实验分组用吡柔比星处理人乳腺癌细胞，建立test组；以未进行吡柔比星处理的人乳腺癌细胞，建立con组；步骤2：RNA提取提取test组和con组中人乳腺癌细胞的lncRNA和mRNA；步骤3：lncRNA芯片数据差异性表达分析(1)导入每个lncRNA探针的预设值；(2)过滤掉在所有芯片的重复探针中Flag均为“‑50”的lncRNA探针；(3)将每张芯片所含重复探针的荧光强度值取中位数；(4)计算每张芯片中重复探针的变异系数值；(5)芯片间采用Invariant set标准化法进行数据均一化，在同样本重复探针中取平均值；(6)依据实验设计和分组情况对lncRNA探针进行对比，计算|FC|>2差异倍数；(7)差异基因列表：选取满足|FC|>2，P

【技术特征摘要】
1.一种利用lncRNA-mRNA共表达网络预测三阴乳腺癌纺锤体组装检查点异常的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：实验分组用吡柔比星处理人乳腺癌细胞，建立test组；以未进行吡柔比星处理的人乳腺癌细胞，建立con组；步骤2：RNA提取提取test组和con组中人乳腺癌细胞的lncRNA和mRNA；步骤3：lncRNA芯片数据差异性表达分析(1)导入每个lncRNA探针的预设值；(2)过滤掉在所有芯片的重复探针中Flag均为“-50”的lncRNA探针；(3)将每张芯片所含重复探针的荧光强度值取中位数；(4)计算每张芯片中重复探针的变异系数值；(5)芯片间采用Invariantset标准化法进行数据均一化，在同样本重复探针中取平均值；(6)依据实验设计和分组情况对lncRNA探针进行对比，计算|FC|>2差异倍数；(7)差异基因列表：选取满足|FC|>2，P<0.05的基因为差异基因；(8)主成分和聚类分析：芯片讯号值经数据log转换及平均数中心化后，依需求筛选出适当数目的差异基因以平均连接算法进行聚类分析；步骤4：lncRNA靶基因分析及调控网络构建利用Targetscan数据库对lncRNA靶基因进行初步预测；利用DAVID数据库将mRNA靶基因进行KEGG通路富集分析，筛选出P＜0.05的基因通路。2.根据权利要求1所述的利用lncRNA-mRNA共表达网络预测三阴乳腺癌纺锤体组装检查点异常的方法，其特征在于，步骤1中的分组具体为：test组：5μM吡柔比星处理...

【专利技术属性】
技术研发人员：范志民，任立群，王亚帝，张祎冰，韦安慧，
申请(专利权)人：范志民，
类型：发明
国别省市：吉林,22