变异型α-辅肌动蛋白-4的抗体制造技术

一种变异型α‑辅肌动蛋白‑4的抗体，所述变异型α‑辅肌动蛋白‑4具有α‑辅肌动蛋白‑4的氨基酸序列的第245位～第263位的区域的氨基酸残基的至少一个置换为其他的氨基酸残基而成的氨基酸序列；所述抗体识别该区域中的置换氨基酸残基的全部或者一部分。

【技术实现步骤摘要】
变异型α-辅肌动蛋白-4的抗体本申请是申请日为2011年9月9日、申请号为201180073344.X、专利技术名称为变异型α-辅肌动蛋白-4的抗体的申请的分案申请。
本专利技术涉及变异型α-辅肌动蛋白-4的抗体，特别涉及α-辅肌动蛋白-4蛋白质的新型剪接变体的单克隆抗体。
技术介绍
α-辅肌动蛋白-4(以下，也称为ACTN4)为α-辅肌动蛋白的一种，在N末端具有球状的肌动蛋白结合结构域、在C末端具有结合有钙的基序(称为EF手性结构域(EFhanddomain))。另外，ACTN4使用其中央部的杆状结构域(roddomain)形成二聚体而成为哑铃状，还使用两端的肌动蛋白结合结构域交联肌动蛋白成为束状(非专利文献1)。哺乳类的α-辅肌动蛋白鉴定为辅肌动蛋白-1～4的4种，辅肌动蛋白-1、-4为非肌肉型，而辅肌动蛋白-2和-3为肌肉型(非专利文献1、2、3、4)。ACTN4为涉及肌动蛋白束状化、促进细胞运动性的肌动蛋白结合蛋白质；确认在被认为细胞运动亢进的细胞突起处富集。进而启示对于癌浸润具有某些积极的贡献的可能性(非专利文献2)。另外，跳过在家族性局灶性肾小球硬化症的家系观察到基因变异的外显子8并插入目前未知的新型外显子8’的类型的选择性剪接变体，在小细胞肺癌中特异地表达，在正常组织中确认到只在精巢表达，所以启示有成为精巢癌抗原的可能性(非专利文献5)。另一方面，根据组织学分析，肺癌分类为小细胞肺癌(称为SCLC)、和非小细胞肺癌(称为非SCLC)两种。SCLC占原发性肺癌的20％，由于发育速度快，多见以伴随着多脏器转移的发展型的案例，以“高恶性度”和“预后不良”而为人所知(非专利文献5)。治疗方面，腺癌和扁平上皮癌占其大半的非SCLC与SCLC的治疗方法不同。病期稍微延长的SCLC具有不能适用外科疗法的特点，非SCLC具有化学疗法的效果低的特点等。因此，可以认为在较早病期鉴别出两者对于进行准确的治疗是重要的。另外，非SCLC中所含的大细胞癌的亚型、大细胞神经内分泌癌(称为LCNEC)占原发性肺癌的3％，与SCLC同样地“预后不良”。均与其他的肺癌不同，具有高的神经内分泌性(非专利文献6)。现有的，SCLC和LCNEC被称为肺原发高恶性度神经内分泌肿瘤(high-gradeneuroendocrinetumor，HGNT)，作为诊断法之一，对于切除标本进行神经内分泌标记(Chromogranin，Synaptophysin，neural-cell-adhesion-molecule(NCAM))的免疫染色(非专利文献7)。但是，这3个标记的阳性率并不高，伪阳性率高被视为问题。因此，期望开发在小细胞肺癌和大细胞神经内分泌癌中具有高的特异性、能够早期检测的新的肿瘤标记。现有技术文献非专利文献1：CellMotil.Cytoskeleton.58，104-111，2004非专利文献2：J.CellBiol.140，1383-1393，1998非专利文献3：Am.J.Hum.Genet.47，62-71，1990非专利文献4：J.Biol.Chem.267，9281-9288，1992非专利文献5：Oncogene，23，5257-5262，2004非专利文献6：ModPathol.19，1358-68，2006非专利文献7：AmJSurgPathol.31，26-32，2007
技术实现思路
专利技术要解决的问题本专利技术目的在于提供：与ACTN4的新型剪接变体蛋白质等变异型ACTN4(以下，称为ACTN4-Va)反应，而不与组成性表达的ACTN4(以下，称为ACTN4-Ub)反应的、ACTN4-Va特异的单克隆抗体、以及产生该抗体的细胞株。另外，本专利技术的目的在于提供：前述ACTN4-Va的检测方法、以及检测用试剂等。用于解决问题的方案本专利技术人等，为了解决上述问题而进行了深入的研究。并且，使用ACTN4-Va或多肽作为抗原，进而使用ACTN4-Ub或多肽进行筛选；接着，用抗原对抗亲和性抗体产生转基因非人哺乳动物进行免疫，能够成功地得到与ACTN4-Va反应而不与ACTN4-Ub反应的抗体即能够识别ACTN4-Va和ACTN4-Ub的单克隆抗体，至此完成本专利技术。即，本专利技术如下。(1)一种变异型α-辅肌动蛋白-4的抗体，所述变异型α-辅肌动蛋白-4具有α-辅肌动蛋白-4的氨基酸序列的第245位～第263位的区域的氨基酸残基的至少一个置换为其他的氨基酸残基而成的氨基酸序列；所述抗体识别该区域中的置换氨基酸残基的全部或者一部分。(2)根据(1)所述的抗体，变异型α-辅肌动蛋白-4是以编码α-辅肌动蛋白-4的DNA的外显子8’为来源的剪接变体。(3)根据(1)所述的抗体，置换氨基酸残基为选自α-辅肌动蛋白-4的氨基酸序列的第248位的甘氨酸、第250位的亮氨酸以及第263位的半胱氨酸组成的组至少一个。(4)根据(1)所述的抗体，包含置换氨基酸残基的氨基酸序列用DIVGTLRPDEKAIMTYVSC(序列号4)表示。(5)根据(1)所述的抗体，抗体为单克隆抗体。(6)根据(5)所述的抗体，由接受号为NITEBP-1140的杂交瘤产生。(7)一种能够与如下抗原决定簇结合的抗体，所述抗原决定簇能够与权利要求5或6所述的抗体结合。(8)根据(5)或(6)所述的抗体，抗体为嵌合抗体、人源化抗体或重组人抗体。(9)上述(1)～(8)的任一项所述的抗体的片段。(10)产生上述(5)或(6)所述的抗体的杂交瘤。(11)接受号为NITEBP-1140的杂交瘤。(12)一种变异型α-辅肌动蛋白-4的抗体的制造方法，其包括：(a)使用部分肽免疫非人哺乳动物的工序，所述部分肽包含α-辅肌动蛋白-4的氨基酸序列的第245位～第263位区域的氨基酸序列、且具有该区域的氨基酸残基的至少一个置换为其他的氨基酸残基的氨基酸序列；以及(b)由该非人哺乳动物提取抗体的工序。(13)一种变异型α-辅肌动蛋白-4的单克隆抗体的制造方法，其包括：(a)使用部分肽免疫非人哺乳动物的工序，所述部分肽包含α-辅肌动蛋白-4的氨基酸序列的第245位～第263位区域的氨基酸序列、且具有该区域的氨基酸残基的至少一个置换为其他的氨基酸残基的氨基酸序列；(b)从前述被免疫的非人哺乳动物提取抗体产生细胞的工序；(c)使工序(b)中得到的抗体产生细胞和骨髓瘤细胞融合的工序；以及(d)从工序(c)中得到的融合细胞提取抗体的工序。(14)根据(12)或(13)所述的方法，非人哺乳动物为导入GANP的非人哺乳动物。(15)一种变异型α-辅肌动蛋白-4的检测方法，其特征在于，使上述(1)～(9)的任一项所述的抗体或其片段与生物试样反应而检测变异型α-辅肌动蛋白-4。(16)一种检测编码变异型α-辅肌动蛋白-4的基因的方法，所述变异型α-辅肌动蛋白-4包含α-辅肌动蛋白-4的氨基酸序列的第245位～第263位的区域的氨基酸残基的至少一个置换为其他的氨基酸残基的氨基酸序列，所述方法使编码该置换氨基酸序列的多核苷酸的探针或者该多核苷酸的扩增用引物与生物试样反应而检测前述基因。(17)根据(16)所述的方法，编码变异型α-辅肌动蛋白-4的基因是以编码α-辅肌动蛋白-4的DNA的外显子8’为来源的剪接变体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种单克隆抗体，其为由序列号4即DIVGTLRPDEKAIMTYVSC表示的氨基酸序列构成的多肽的单克隆抗体，其中，所述单克隆抗体能够与ACTN4‑Va反应，而不与ACTN4‑Ub反应，并且由保藏编号为NITE BP‑1140的杂交瘤产生。

【技术特征摘要】
1.一种单克隆抗体，其为由序列号4即DIVGTLRPDEKAIMTYVSC表示的氨基酸序列构成的多肽的单克隆抗体，其中，所述单克隆抗体能够与ACTN4-Va反应，而不与ACTN4-Ub反应，并且由保藏编号为NITEBP-1140的杂交瘤产生。2.一种能够与如下抗原决定簇结合的抗体，所述抗原决定簇能够与权利要求1所述的抗体结合，所述抗原决定簇具有用序列号4即DIVGTLRPDEKAIMTYVSC表示的氨基酸序列。3.根据权利要求1所述的抗体，其中，抗体为嵌合抗体、人源化抗体或者重组人抗体。4.根据权利要求1所述的抗体，其中，将由保藏编号为NITEBP-1140的杂交瘤产生的抗体制备成嵌合抗体、人源化抗体或者重组人抗体。5.一种保藏编号为NITEBP-1140的杂交瘤。6.一种变异型α-辅肌动蛋白-4的单克隆抗体的制造方法，其包括：(a)使用由序列号4即DIVGTLRPDEKAIMTYVSC表示的氨基酸序列构成的多肽免疫非人哺乳动物的工序；(b)从被免疫的所述非人哺乳动物提取抗体产生细胞的工序；(c)使工序(b)中得到的抗体产生细胞和骨髓瘤细胞融合而得到保藏编号为NITEBP-1140的杂交瘤的工序；...

【专利技术属性】
技术研发人员：品川真吾，伊藤一成，渡嘉敷佳美，宫本显友，本田一文，山田哲司，
申请(专利权)人：转基因股份有限公司，日本国立癌症研究中心，
类型：发明
国别省市：日本,JP